四君子汤对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长及PD-L1表达的影响*

李朵璐，张待娣，杨 盟，柴玉娜

(郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052)

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中较为难治的特殊类型，具有雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体免疫组化标记均为阴性的特点。TNBC的病因至今尚未明确，肿瘤细胞免疫逃逸是目前公认的治疗障碍。近年来发现，以程序性死亡-1因子(programmed death-1, PD-1)及其配体(programmed death ligand 1, PD-L1)为阻断靶点进行免疫治疗，能够抑制TNBC化疗耐药[1-2]。中医学治疗TNBC的关键在于益气健脾。已有研究证明：益气健脾方药四君子汤可显著提高乳腺癌患者的生存质量[3]，调节乳腺癌患者的免疫系统功能，主要成分能够降低PD-L1表达[4]。本研究以前期实验筛选出的PD-L1高表达TNBC细胞为研究对象，观察四君子汤对细胞增殖、凋亡及免疫相关因子PD-L1表达的影响，以期为深入研究TNBC的发病机制、寻找可能的药物靶标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与细胞培养

人三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)购自美国典型培养物保藏中心。细胞均使用含体积分数100 mL/L 胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640完全培养基在37 ℃、饱和湿度、体积分数50 mL/L CO2的细胞培养箱中培养。

1.2 药品、试剂与仪器

四君子汤由人参、白术、茯苓及甘草4种中药组成。药材购自郑州大学第一附属医院药房，加入10倍体积纯水浸泡1 h，然后煎煮提取1.5 h，纱布过滤收集滤液，静置沉淀取上清液，放入旋转蒸发仪浓缩后，用烘干箱干燥，得到干粉。四君子汤提取干粉采用高效液相色谱进行质量控制。使用前用天平称取四君子汤干粉10 mg，用5 mL培养基配成高剂量(2 g/L)溶液，用无菌滤膜过滤后用培养基依次梯度稀释成中剂量(1 g/L)溶液和低剂量(0.1 g/L)溶液。紫杉醇(Paclitaxel，10 mM)，购自MCE公司。先将紫杉醇用DMSO稀释成10 μM 的母液储存，使用前再加入培养基稀释至5 nM。 细胞增殖/毒性实验(cell counting kit-8,CCK8)试剂盒,购自US Everbright 公司，Cat.No.C6005-500T，Lot.No.FC0720；FITC Annexin V/ PI 细胞凋亡检测试剂盒，购自GeneCopoeia公司，Cat. No. A026，Lot. No. A2K1626。Odyssey CLX型红外荧光扫描成像系统，美国LI-COR公司产品；MK3型酶标仪，美国Molecular Devices分子仪器有限公司产品；FACSCanto II型流式细胞仪，美国BD公司产品。

1.3 检测指标

1.3.1 CCK-8法检测细胞增殖

将处于对数生长期的TBNC细胞MDA-MB-231接种于96孔板，调整细胞密度，每孔体积100 μL，置于培养箱(37 ℃、50 mL/L CO2)培养；待细胞完全贴壁后，分别更换含有高(2 g/L)、中(1 g/L)、低剂量(0.1 g/L)的四君子汤提取物和紫杉醇，以及不含二者的培养液100 μL；分别在孵育24，48，72 h后，加入10 μL CCK-8溶液。另设调零孔，每组5个复孔，将培养板在培养箱中孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度OD值，计算出各组细胞抑制率。抑制率=[(对照组OD值-本底OD值)-(给药组OD值-本底OD值)]/(对照组OD值-本底OD值)×100%。

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡

采用FITC Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。选择处于对数生长期的TBNC细胞MDA-MB-231接种于6孔板，待细胞贴壁完全后，加入含有高(2 g/L)、中(1 g/L)、低剂量(0.1 g/L)的四君子汤提取物和紫杉醇，以及不含二者的培养液，培养箱培养48 h。根据以下步骤操作：①用不含EDTA 的胰酶消化后，300×g，4 ℃离心5 min收集细胞。②准备阳性实验对照组，使用合适的方法诱导细胞凋亡，同时准备未经凋亡诱导处理的细胞作为空白对照组。③用 4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300×g，4 ℃离心 5 min。④配制 1×Annexin-binding buffer。用去离子水按1∶5稀释5×Annexin-binding buffer(组份C)(2 mL 5×Annexin-binding buffer+8 mL 去离子水)。⑤用 1×Annexin-binding buffer 重悬细胞，调节其浓度为1×106细胞/mL。⑥取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL FITC Annexin V(组份 A)和 1～2 μL PI(组份B)，轻轻混匀。⑦室温、避光、反应 15 min。⑧加入400 μL 1×Annexin-binding buffer，轻柔混匀，冰上放置。⑨在1 h内，进行流式细胞仪的观察和检测，激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm。FITC Annexin V绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI 红色荧光通过 PI 通道(FL2 或 FL3)检测。

1.3.3 Western blotting检测细胞中PD-L1表达水平

用细胞裂解液处理高(2 g/L)、中(1 g/L)、低剂量(0.1g/L)四君子汤提取物和紫杉醇培养的TBNC细胞MDA-MB-231，提取总蛋白，采用BCA法测蛋白浓度；取30 μg蛋白加入上样缓冲液，70 ℃变性10 min，聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭1h后依次加入相应的一抗和二抗孵育。室温下TBST漂洗孵育过的条带3次，每次5 min。使用Odyssey双色红外荧光成像系统进行扫膜曝光。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 各组TNBC细胞MDA-MB-231抑制率对比

各时间点抑制作用以紫杉醇组最为显著；四君子汤各剂量组，在72 h时抑制作用最明显，但即使是高剂量四君子汤组，抑制率也显著低于紫杉醇组，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组TNBC细胞MDA-MB-231抑制率对比

组别 剂量24 h抑制率/%48 h抑制率/%72 h抑制率/%空白对照组----紫杉醇组5 nM8.1629.5849.88四君子汤高剂量组2.0 g/L3.337.9210.21四君子汤中剂量组1.0 g/L0.451.172.97四君子汤低剂量组0.1 g/L0.050.080.12

2.2 各组TNBC细胞MDA-MB-231凋亡率对比

空白对照组、紫杉醇组、四君子汤高(2 g/L)、中(1 g/L)、低剂量(0.1 g/L)组的MDA-MB-231凋亡率依次是12.23%、21.40%、24.25%、16.90%、15.37%。与空白对照组对比，四君子汤高剂量组细胞凋亡率显著增加，差别有统计学意义(P<0.05)。见图1。

A.空白细胞组；B.四君子汤低剂量组；C.四君子汤中剂量组；D.四君子汤高剂量组；E.紫杉醇组图1 药物处理48 h后各组TNBC细胞MDA-MB-231凋亡率

2.3 各组TNBC细胞MDA-MB-231中PD-L1表达对比

与空白对照组对比，四君子汤高(2 g/L)、中(1 g/L)、低剂量(0.1g/L)组PD-L1表达量均有所降低，其中四君子汤高剂量组较之差别有统计学意义(P<0.05)。见图2。

与空白对照组对比，*P<0.05图2 药物处理48 h后各组TNBC细胞MDA-MB-231中PD-L1表达

3 讨 论

三阴性乳腺癌由于具有特殊的免疫表型，对大多数内分泌治疗及针对HER2过表达、雌孕激素受体表达阳性的乳腺癌的靶向治疗不敏感，目前临床以化疗为主，5年生存率<15%，预后较其他类型乳腺癌差[5]。免疫逃逸是肿瘤细胞逃避机体杀伤作用的重要途径。和正常人相比，肿瘤患者外周血单核细胞的CD8+T细胞、CD4+T细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的数量均会减少，同时，这些免疫细胞的功能和活性也会下降，例如细胞毒活性、细胞因子的分泌，以及抗原加工与提呈细胞能力。随着肿瘤的动态发展，免疫细胞的特殊成分和性质发生高强度的动态变化而形成的肿瘤微环境会不断变化[6]。越来越多的研究证明，免疫逃逸相关分子对判断TNBC的预后和预测其治疗靶标有重要作用。肿瘤浸润淋巴细胞作为免疫逃逸的重要参与者，其表面的CD4/CD8比例变化对TNBC预后有指导价值[7]。TNBC中免疫抑制性代谢物吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)的表达能较好反应肿瘤的突变量，阻断IDO1通路可能成为该病有效的治疗途径[8]；跨膜粘蛋白MUC1能够作用于NF-κB及CD8+T细胞等途径抑制TNBC细胞表面PD-L1的表达[9]。这些最新研究均提示免疫逃逸分子在TNBC靶向治疗中的重要意义。笔者前期研究发现，TNBC细胞系中PD-L1高表达，降低PD-L1的表达能够增加乳腺癌耐药细胞的药物敏感性。现在越来越多的实验研究表明，中药可以干预乳腺癌的免疫效应。

现代医学表明，健脾补肾方、疏肝健脾方等能够影响IFN-γ、IL-2、TGF-β，以及肿瘤细胞的凋亡，CD8+T细胞、CD4+T细胞、Treg等淋巴细胞的分化，对抑制肿瘤细胞免疫耐受有明显作用[10-11]。徐川等的研究显示，益气健脾方能够对乳腺癌免疫耐受有较好的改善作用[12]。以上研究表明，益气健脾在本质上和西医学降低肿瘤细胞免疫逃逸、提高机体免疫力的认识是一致的。健脾益气方四君子汤由人参、白术、茯苓、甘草组成，具有补益气血、益气健脾之功效。方中人参为君，甘温益气，健脾养胃。臣以苦温之白术，健脾燥湿，加强益气助运之力。佐以甘淡茯苓，健脾渗湿，苓术相配，则健脾祛湿之功益著。使以炙甘草，益气和中，调和诸药。四药配伍，共奏益气健脾之效。最新研究发现：四君子汤中君药人参能够抑制乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长，能促进乳腺癌细胞凋亡[13-14]，对免疫器官、免疫细胞及免疫因子均有调控作用[15]，并能够抑制PD-L1的表达[16]。本研究中，四君子汤虽然对三阴性乳腺癌细胞增殖没有明显的抑制作用，但是流式细胞术检测表明，高剂量四君子汤具有能够诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的作用。

此外，本研究观察了不同剂量的四君子汤对三阴性乳腺癌细胞中PD-L1表达的影响，结果显示：四君子汤高、中、低剂量组PD-L1表达量均有所降低。PD-1是TNBC发生免疫逃逸的重要参与者，以PD-1和其配体PD-L1为阻断靶点是TNBC免疫治疗领域的重要突破。通过应用PD-1/PD-L1抑制剂，能够逆转肿瘤细胞免疫逃逸的发生，增强机体免疫力。有研究表明，在乳腺癌小鼠模型及乳腺癌患者中，应用PD-1抑制剂显示了较好的抗肿瘤活性[17-18]。因此，TNBC在目前缺少明显的靶向药物和化疗耐药的情况下，以增强和调控患者免疫功能的免疫疗法具有潜力。本研究为进一步研究中医药治疗TNBC的作用机制、探索TNBC的靶向治疗奠定了实验基础。