化学统计学在不同年份和不同产地郁金鉴别中的应用

李宝辉, 李冬晖, 倪永年

(1.解放军989医院中心实验室,河南洛阳 471031; 2.南昌大学化学系,江西南昌 330031)

中药以其药效作用多样和低毒而闻名,而随着对中药认知度的不断提高和使用,中药正在走向世界并逐渐为国内外民众所认可。郁金是较早使用的中药材,并被记录于苏敬的《唐本草》,用药历史距今已有1 400年。郁金广泛用于活血止痛、行气解郁、清心凉血、利胆退黄、抗肿瘤、降血脂、抗氧化、杀菌、抗病毒和抗炎。其主要的两大活性组分为姜黄素类化合物和挥发油类化合物。地域对中药材的药性影响很大,通常把较其他产区的同种药材品质更佳、疗效更好，并具有较高知名度的药材称为道地药材[1]。四川产郁金被称作为郁金的道地药材,广西、云南、浙江一带也都产郁金药材,但质量不如四川产郁金。由于价格等因素市场上可能流通着以次充好的郁金药材,而且一般很难用肉眼来进行产地鉴别。不同于西药的单一组分,多数中药药效由多种药效组分配伍而发挥其治疗的作用,因此中药的质量控制和质量保证还存在一定困难和挑战。

指纹图谱技术被认为是分析复杂中药材的重要方法,在化学统计学的帮助下,能从其指纹图谱中挖掘复杂体系的有效信息,去冗求简,并构建准确快速识别的数据库[2 - 3]。高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)由于具有通用、稳健和可重复性,常被用来鉴定复杂物质(例如中药和食品)的组成或有效成分、品质和真伪。特别是HPLC和GC具有非常强的分离能力,因此，由这两种色谱方法构建的样品指纹图谱可以清晰确认某一种或几种化合物成分在复杂物质定性中的作用[4 - 5]。Qin等[6]应用GC-MS法研究了黄丝郁金(C.Longa)、蓬莪术(C.Phaeocaulis)、温郁金(C.Wenyujin)和广西莪术(C.Kwangsiesis)的块根和根茎,并发现了四种标志物芳姜黄烯(ar-Curcumene)、芳姜黄酮(ar-Turmerone)、α-姜黄酮(α-Turmerone)和β- 姜黄酮(β-Turmerone)对块根和根茎的鉴别起到了重要作用。Li等[7]应用HPLC-MS法定性定量分析郁金药材中的姜黄素类化合物,发现不同产地和不同栽培年限药材中姜黄素类化合物的含量差别较大。Ni等[8]应用GC-MS法和HPLC法研究复杂物质(莪术)并构建其色谱指纹图谱,经统计学方法处理后,两类数据得到比较好的融合,从而提高了对莪术样品采用指纹图谱进行判别鉴定的准确性。近红外光谱(NIRS)测定具有快速、无损、需要样品量少、能实时监测等特点,目前已被广泛应用于工农业生产过程中复杂物质的检测和鉴定。NIRS测量的是有机分子中含氢基团(-OH、-NH、-CH)振动的合频和各级倍频峰吸收,因此其构建的指纹图谱能表达某类或几类化合物的加和作用。NIRS的复杂性决定其依靠善于处理复杂信号、挖掘隐藏信息、可视化分析结果的统计学方法来解析[9 - 10]。

本文应用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)和顶空-气相色谱-质谱法(HS-GC-MS)分别测定郁金药材水提物和挥发油的化合物组分;并应用HPLC、GC和NIR分别构建郁金药材指纹图谱,以期有的放矢高效用好中药药材。

1 实验部分

1.1 郁金样品的采集

本研究共采集了三个产地的53份郁金样品,其中四川2016批次8份(1#～8#),四川2017批次12份(9#～20#),广西2016批次8份(21#～28#),广西2017批次10份(29#～38#),浙江2017批次15份(39#～53#)。

1.2 样品前处理

将郁金样品打碎并过40目筛后,保存于自封塑料袋中,并尽快完成HS-GC-MS和NIRS检测。样品的HPLC-MS测定前处理如下:准确称取1.00 g郁金粉末样品,加入20 mL二次蒸馏水，于50 ℃超声30 min,之后将提取物过滤于25 mL容量瓶中。液相色谱进样前,将提取物过0.45 μm的滤膜。

1.3 检测仪器及参数设置

NIRS测定:日立UV-4100紫外-可见-近红外光谱仪,反射模式,扫程200～2 500 nm,扫描步长2 nm,每个样品扫描32次取其平均吸光度值。

HS-GC-MS测定:配备岛津AOC 5000顶空自动进样器的岛津QP 2010 GC-MS仪,RTX-5毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。HS参数如下:温度100 ℃,500 r/min转动25 min。GC参数如下:进样体积250 μL,流速1.0 mL/min,进样口温度230 ℃,柱温程序,初始70 ℃(保持5 min)，以10 ℃/min升温至140 ℃(保持2 min)。MS测定参数如下:接口温度230 ℃,扫描范围m/z30～500,扫描频率0.30 scan/s。

HPLC-MS测定:Waters AQ 4000/2695 HPLC-MS仪,Zorbax Ecllipse Plus-C18柱(250×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱温20 ℃,检测波长270 nm,进样体积20 μL。流动相及梯度如下:流动相为甲醇(A)和0.1%H3PO4(B),0～4 min，95%～90%B；4～30 min，90%～50%B；30～50 min，50%～8%B;MS条件如下:电喷雾离子化检测器,解离温度350 ℃,离子源温度110 ℃,扫描范围m/z50～1 000。

1.4 化学统计学分析

由以上测试所得的郁金样品数据,包括NIRS、GC和HPLC,均在Matlab 7.0平台上完成统计运算。在本研究中,我们采用了KK-分析法(KK-Analysis)对测量数据进行分析。KK-分析法是基于Matlab语言并包含多种无监督模式识别方法,如自组织地图(SOM)和聚类分析。其原理如下[11]:SOM首先由Teuvo Kohonen提出，因此也称做Kohonen地图，它是一种将原始的多维数据压缩成更低维数据的方法,这种压缩技术叫做向量量化;SOM创造一个包含数据集模型的拓扑关系的信息网络。

SOM是由很多节点组成的,每个节点被分配一个权重向量Wi;在某种意义上节点组成一个小的群落;Wi和原始的特征向量具有相同的维度。迭代步骤如下:

(1)

核心步骤就是鉴定距离真实输入数据最近的节点，以及对于第j个模型来说的最佳匹配单元(BMU)。一旦确定了BMU,它的权重就按照所谓的学习率逐渐调整。权重的调整过程如下:

Wi(t+1)=Wi(t)+φ(Δ,t)λ(t)(WI(t)-Vj(t))

(2)

式中φ是描述依赖节点升级的距离,而φ(Δ,t)是BMU的最大值。

聚类分析可以分为无级区分和分级区分两种技术,本文应用到的是无级区分策略,这种模式下需要预定义样品分为几个类,每次预定义的类数目发生改变,整个聚类过程将重新开始。在模糊聚类分析中,在一定程度上每一个模型都有可能属于任何一个可能的类,因此一个模型到底属于哪个类是通过向量表达的。这个区分过程是通过一个矩阵M×K表示的,M是整个数据机的模型数目,K表示类数目。区分的优化过程是通过最小化目标函数实现的。

2 实验结果

2.1 HPLC-MS水提物组分分析和统计学

将HPLC色谱数据结果导入指纹图谱相似度软件进行分析,发现三个产地5个批次的郁金样品共有21组共有峰(标记为L1～L21),见图1(a)。经过MS分子量以及组分最大紫外吸收的比对,有12个组分被鉴定(表1),分别是:没药姜黄醇B(Bisacurone B)(L2),姜黄素(Curcumin)(L4),去甲氧基姜黄素(Demethoxycurcumin)(L5),二去甲氧基姜黄素(Bisdemethoxycurcumin)(L6),莪术醇(Curcumol)(L7),吉马酮(Germacrone)(L11),芳姜黄酮(Arturmerone)(L12),莪术二酮(Curdione)(L13),莪术醇(Curcumenol)(L15),异莪术醇(Isocurcumenol)(L16),姜黄醇酮(Curcolone)(L18),姜黄醇(Curcumone)(L19)。

将21组共有峰数据作为变量输入Matlab作为平台的KK-分析法,进行聚类分析,结果见图2(a)。发现53个样品大致分为三类,其中四川2016和2017两批次样品归为一类,广西2017和浙江2017批次样品水提物差别不大,广西2016批样品独自为一类;另外浙江2017批4个样品(41#,44#,51#和53#)和广西2016批次样品较为相似。

表1 HPLC-MS法分析郁金样品组分特性

2.2 HS-GC-MS挥发油组份分析和统计学

将HS-GC测定数据导入指纹图谱相似度软件分析,发现三个产地5个批次的郁金样品具有14组共有峰(标记为G1～G14),见图1(b)。经过GC-MS化合物相似度软件查询并与文献作比对,这14个化合物分别确定为:3-蒈烯(3-carene)(G1)，α-蒎烯(α-Pinene)(G2)，莰烯(Camphene)(G3)，β-蒎烯(β-Pinene)(G4)，桉油精(Eucalyptol)(G5)，樟脑(Camphor)(G6)，龙脑(Borneol)(G7)，石竹烯(Caryophyllene)(G8)，α-檀香醇(α-Santalol)(G9)，α-石竹烯(α-Caryophyllene)(G10)，β-人参烯(β-Panasinsene)(G11)，臭樟脑(Napthalene)(G12)，广藿香烯(Patchonlene)(G13)，异香树烯(Isoaromadendren)(G14)。

将14个共有峰作为变量，利用前述KK-分析法做聚类分析,结果见图2(b)。发现三产地5批次的53份郁金样品大致分为三类,其中四川2016和2017批次郁金样品的挥发油组分含量较为相似,广西2016和2017批次的样品差别不大,浙江2017批次独成聚为一类,另外浙江2017批次3个样品(44#,51#和53#)不能和四川的样品区分。

图1 三个产地5个批次的53份郁金样品HPLC(a)、HS-GC(b)和NIRS(c)检测结果 Fig.1 The measured spectra of HPLC(a),HS-GC(b) and NIRS(c) for Radix Curcumae samples from three origins with five batches

2.3 NIRS全组分分析和统计学

由于样品的近红外光谱测量易受温度、散射和颗粒不均匀等因素的影响,故我们采用标准正态变量变换(SNVT)来校正测得的NIRS曲线(图1(c))[12]。进而将全光谱作为变量做统计分析,结果见图2(c)。三产地5批次的郁金样品可分为5类:四川2016批次,四川2017批次,广西2016批次,广西2017批次和浙江2017批次。同时我们可以看到浙江2017批次中,39#和广西2016批次较相似,44#和四川2017批次较相似,53#和广西2017批次分为一组。可见不同产地不同批次间确实存在一定的差异。

为了验证无监督模式识别结果的准确度，我们将每组样品按2:1随机分为校正集组(四川2016批次5个,四川2017批次8个,广西2016批次5个,广西2017批次7个,浙江2017批次10个)和验证集组(四川2016批次3个,四川2017批次4个,广西2016批次3个,广西2017批次-3个,浙江2017批次5个)。应用经典的有监督模式识别方法最小二乘-支持向量机(LS-SVM)[13]处理校正组数据并建立验证模型,进而用于对校正组和验证组分别进行识别,可以发现校正组样品识别率为100%,而验证组识别率为94.7%(参数gam=27.21,sig2=105.84)。

图2 三个产地5个批次的53份郁金样品HPLC(a)、HS-GC(b)和NIRS(c)检测结果的聚类分析结果Fig.2 The clustering results of HPLC(a),HS-GC(b) and NIRS(c) for the Radix Curcumae samples from three origins with five batches

3 结论

本研究应用HPLC-MS和GC-MS分别分析中药郁金的水提物和挥发油,26个化合物组分被准确鉴定。HPLC指纹图谱发现四川2016和2017批次水提物几无差别,但广西2016和2017批次差别较大。很明显依据郁金药材水提物的分析结果发现广西2017和浙江2017批次的郁金药材质量高于广西2016批次。由GC指纹图谱发现四川2016和2017批次挥发油类物质之间差别不大,而广西2016批次和广西2017批次挥发油类物质含量较相似,浙江、广西和四川3个产地郁金药材的挥发油成分含量各不相同。本研究结果在医院临床实践或者工厂配方制剂生产过程中可起到参考价值,以提高和控制产品的质量。本研究还应用NIRs对中药郁金的全组分测定,经统计学方法移除基线漂移和矫正散射影响后,构建NIRs指纹图谱,由NIRs解析的结果表明3个产地5个批次的郁金药材存在组分间的差异,可以被鉴定并区分。