基于核酸i-motif结构的pH响应荧光传感器

吕 岩， 贾美琪， 周会鹏， 廖冬丽， 艾永兴， 于 聪

(1.吉林大学动物科学学院，吉林长春130062； 2.中国科学院长春应用化学研究所，电分析化学国家重点实验室，吉林长春 130022； 3.长春理工大学，化学与环境工程学院，吉林长春 130022)

刺激响应的荧光传感在构筑分子逻辑运算器件、智能响应的传感开关，以及信号响应性智能材料等领域有着广泛的应用[1 - 3]。另外，样品溶液pH值检测在工农业生产、生物医药、环境监测、疾病诊断等方面有着重要的应用。正常状态下，人体pH值维持在7.3～7.4之间，而pH值的异常波动，会造成机体健康的严重损害。因此，pH响应传感器的研究具有重要意义[4]。

近年来，研究发现一种富含胞嘧啶(Cytosine,C)碱基的DNA重复片段，在特定条件下可形成称为i-motif 的结构，这种特殊DNA结构的形成和生物功能越来越受到广泛关注[5 - 8]。i-motif DNA分子在酸性条件下(pH<6.3)发生C碱基的部分质子化，质子化的C碱基与未质子化的C碱基通过氢键相互作用形成稳定的平行双螺旋。两个平行双螺旋上的C碱基对之间交替排列和互相嵌入形成四链体结构i-motif。在中性或碱性条件下四链体结构解开成为单链结构[7 - 13]。i-motif结构对pH非常敏感，其响应灵敏度可以克服Henderson-Hasselbalch的限制(即ΔpH10-90窄至0.2个pH单元)[14 - 15]。因此，通过pH值的细微改变可以实现对i-motif DNA结构的调节，进而用于pH值的灵敏传感研究，以及i-motif结构调控研究[16 - 17]。此外，SYBR Green I(SG)是一种结合于双链DNA双螺旋小沟区域的具有绿色发射波长的荧光染料。在游离或与单链DNA结合状态下，SYBR Green I荧光较弱，其一旦与双链DNA结合，荧光将大大增强[18]，利用这种差异性变化，SYBR Green I作为荧光信号输出单元已被广泛研究[19 - 22]。

本研究利用i-motif DNA和SYBR Green I染料的独特性质，设计了一种灵敏的新型pH响应荧光传感器。选择富含C碱基的DNA链及其互补链，可以在pH值为5.0～7.5的范围内进行荧光响应，从而实现了对pH的快速传感。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Fluoromax-4荧光分光光度计(美国，Horiba JobinYvon Inc.)；Cary 50紫外-可见分光光度计(美国，Varian Inc.,CA)；J-820圆二色光谱仪(日本，佳司科)。

核酸链i-motif DNA：5′-CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC-3′，C-DNA：5′-GTT AGTGTT AGTGTT AG-3′(下划线为互补部分)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。荧光染料SYBR Green I(10,000 ×)购买于上海捷瑞生物工程(上海) 有限公司。DNA溶液在4 ℃储存。所用的其它试剂都是分析纯试剂。所有溶液均用Milli-Q A10过滤设备(Millipore,Billerica,MA,USA)处理的超纯水配制。

1.2 实验过程

选择250 μL检测体系，20 nmol/L i-motif DNA，20 nmol/L C-DNA,10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=5.0～8.0)，SYBR Green I(0.15×)，5 mmol/L MgCl2。将样品溶液置于比色皿中，于室温下(25 ℃)检测荧光信号。荧光检测的激发波长为498 nm，激发和发射狭缝均为2 nm。扫描范围为510～615 nm。检测温度为室温(25 ℃)。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

图1 pH响应荧光检测原理的示意图Fig.1 Schematic illustration of the principle of the pH responsive fluorescence sensing

实验原理如图1所示。根据i-motif DNA在不同pH值条件下结构不同，以及染料SYBR Green I对单双链DNA的不同响应特性，设计了一种新型的pH响应荧光传感器。在溶液pH值比较低的情况下，富含C碱基的核酸链以i-motif结构，即四链体DNA结构存在，另外一条与之互补的DNA链以游离的单链形式存在。加入SYBR Green I之后，由于该染料与单链DNA作用弱，故在pH值低的条件下荧光强度弱。随着溶液pH值的逐渐升高，i-motif结构逐渐解离成自由的单链DNA，并能与其互补的核酸链通过碱基配对原则形成双链DNA，此时加入SYBR Green I，其与双螺旋DNA的结合使得荧光强度显著增强。通过这种荧光强度的差异可实现溶液pH响应的荧光传感。

2.2 盐浓度选择

图2 MgCl2(A)和NaCl(B)浓度对pH响应荧光检测的影响Fig.2 Effect of MgCl2(A) and NaCl(B) concentrations on pH responsive fluorescence sensing i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0,pH=7.5);SYBR Green I(0.15 ×).

由于双链DNA的形成与盐浓度有重要关系，我们首先考察了不同浓度MgCl2、NaCl对pH响应的荧光的影响，如图2所示。选定pH=5.0及pH=7.5两个pH值，MgCl2浓度从0至60 mmol/L，NaCl浓度从0至400 mmol/L逐渐增加。由图2A可看出,荧光强度随MgCl2浓度增加而逐渐降低，离子对SYBR Green I荧光起猝灭作用。pH=7.5时，荧光强度随MgCl2浓度先升高后降低，在5 mmol/L MgCl2存在时，荧光强度达到最大。这是离子对SYBR Green I荧光的猝灭作用，以及对双链DNA的稳定作用协同作用的结果。另外，考察了NaCl浓度对溶液pH荧光响应的影响(图2B)，实验结果同MgCl2的趋势一致。根据SYBR Green I荧光强度随盐浓度的变化，结合试剂的用量，确定5 mmol/L MgCl2作为最佳的检测体系。

2.3 不同pH值条件下SYBR Green I的荧光强度

图3 SYBR Green I在不同pH条件下的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of SYBR Green I under different pH Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0,pH=7.5);MgCl2 5 mmol/L;SYBR Green I(0.15 ×).

图3是只有SYBR Green I染料存在时，不同pH值条件下的荧光光谱。从图中可以看出，无论是在pH=5.0还是在pH=7.5时，SYBR Green I的荧光都非常弱，强度基本没有变化。说明pH值的改变，对SYBR Green I的荧光基本没有影响。

2.4 SYBR Green I浓度选择

如图4所示，i-motif DNA和C-DNA碱基互补配对形成双链DNA时，考察了SYBR Green I不同浓度时的荧光强度变化。选定pH=7.5，SYBR Green I浓度从0×至0.50×。从图4可以看出，随着SYBR Green I浓度的增大，荧光强度逐渐增大。当浓度达到0.15×时，荧光信号达到最大值；当浓度增大到0.50×时，荧光信号稳定且没有强度的进一步增加。最终确定SYBR Green I(0.15×)为最佳的检测体系。

图4 i-motif DNA和C-DNA存在下不同浓度SYBR Green I在pH=7.5时的荧光强度变化Fig.4 Fluorescence intensity changes of different concentrations of SYBR Green I in the presence of i-motif DNA and C-DNA at pH=7.5 Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=7.5);MgCl2 5 mmol/L;i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L,SYBR Green I(0×,0.025×,0.05×,0.075×,0.10×,0.125×,0.15×,0.30×,0.50×).

2.5 反应时间的选择

图5是在522 nm波长处，SYBR Green I与i-motif DNA和C-DNA随时间变化的荧光强度曲线。从图5中可以看出，i-motif DNA和C-DNA碱基互补配对形成双链DNA，加入SYBR Green I后荧光强度迅速增强，200 s时达到最大值，且1 000 s内稳定不变。综合考虑，选定200 s为体系的最佳反应时间。

2.6 SYBR Green I与单链DNA作用考察

考察了不同pH值下SYBR Green I与单链DNA相互作用的情况。结果表明，不论是i-motif DNA还是C-DNA，在pH=5.0和pH=7.5时，与SYBR Green I作用后的荧光都很弱，其强度都没有发生明显变化，说明了SYBR Green I与单链DNA作用很弱。

图6是不同pH值条件下i-motif DNA的圆二色光谱图。由图可知，在pH=5.0时，有一个288 nm的正峰和259 nm的负峰。而当pH达到7.5时，273 nm出现一个正峰，244 nm处有一个负峰，峰的位置发生明显变化，说明富含C的i-motif DNA随pH值的升高而发生了构象变化，由四链体结构转变成自由的单链[8]。

2.7 不同pH值下荧光曲线

按照优化的传感体系，我们进行了pH的荧光响应实验。如图7所示，反应体系的荧光强度随着pH值增大而逐渐增强，说明随pH值升高形成的双链DNA也越多。当pH值达到7.5时，荧光信号达到最大值，此时荧光信号增强了4倍多。并且在pH=5.0～7.5范围内实现了灵敏的pH快速响应，pH分辨率达到了0.1个pH单元。

图5 反应时间对体系荧光强度的影响Fig.5 Effect of reaction time on SYBR Green I in the presence of dsDNA i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=7.5);SYBR Green I(0.15×);MgCl2:5 mmol/L;λ=522 nm.

图6 不同pH值下的圆二色(CD)光谱Fig.6 CD spectra of i-motif DNA in pH=7.5(curve 1) and pH=5.0(curve 2) buffer:i-motif DNA:2 μmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0,pH=7.5);MgCl2:5 mmol/L.

图7 不同pH值下荧光曲线Fig.7 Emission intensity changes of SYBR Green I at 522 nm at different pH(pH=5.0 to 8.0) i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0 to pH=8.0);SYBR Green I(0.15×);MgCl2:5 mmol/L

3 结论

成功设计并展示了一种基于核酸i-motif结构转变和SYBR Green I染料特性的简单、快速、灵敏的pH传感器。通过不同pH条件下荧光信号和圆二色谱峰位的变化，证明了核酸i-motif的结构转变和其与SYBR Green I染料结合能力的变化。我们设计的这种富含胞嘧啶C碱基的i-motif的结构对pH变化非常敏感，该传感器在pH=5.0～7.5范围内可对溶液的pH进行快速响应，pH分辨率达到了0.1个pH单元。我们将对核酸i-motif的结构进一步优化与设计，以期在细胞等复杂生物体系内进行微小pH值的传感研究。