基于气相色谱-质谱技术与多元统计分析对不同栗香特征绿茶判别分析

尹洪旭，杨艳芹，姚月凤，张铭铭，王家勤，江用文，袁海波,*

（1.中国农业科学院茶叶研究所 浙江省茶叶加工工程重点实验室，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

茶叶香气是决定名优茶品质的重要因子之一，协调而愉快的香气不仅是评价名优绿茶等级的标准，也是消费者选择的重要依据。栗香是优质绿茶所拥有的特征香型之一，主要表现为熟栗子或嫩玉米的香气特色，与鲜叶品种、原料品质和加工工艺等有关。随着感官技术的日趋成熟和细化，根据栗香香型表现、香气强度等感官表征上的差异，现代感官评审中又将栗香细分为嫩栗香、板栗香、熟栗香等不同香型[1-3]。板栗香是一种基于特定品种的坚果香气，多见于制作中火功恰到好处的高档绿茶及个别品种茶[4]；嫩栗香是在栗香风味的基础上，突显柔和、新鲜幽雅的毫茶香，多见于原料幼嫩、采制精细的高档绿茶；熟栗香一般在足火的加工条件下，形成一种由栗香到高火香过渡的香气特征。

目前茶叶香型的辨别主要依靠人工感官审评，结果存在个体误差且需要丰富的经验。因此，为使不同栗香特征的绿茶分类更科学直观，利用现代仪器分析对茶叶香气进行分析检测，结合多元统计分析技术，对栗香绿茶香气品质进行评价和预测是行之有效的方法。主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和系统聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）是目前食品领域比较常见的多元统计技术，广泛应用于白酒[5-6]、龙眼[7]、橄榄油[8]等食品真假判别、质量评价[6]和年份产地鉴别[9]等方面。Jumtee等[10]采用真空水蒸馏法-质谱联用分析日本煎茶的香气组分，通过PLSDA与茶叶感官评价建立回归，实现了对不同煎茶等级的有效区分，并得到15 种对日本煎茶香气品质贡献大的香气组分。本研究将PCA、PLS-DA和HCA多元统计方法用于对不同栗香特征绿茶的香气特征判别分析，并探索其相关性大的香气物质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同栗香风味绿茶共有18 个，其中嫩栗香7 个，熟栗香5 个，板栗香6 个，样品具体信息如表1所示。

表1 栗香型绿茶样品信息Table 1 Detailed information about chestnut-like green tea

1.2 仪器与设备

7000C-7890B型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；250 mL自制顶空微萃取瓶、固相微萃取（solid phase micro extraction，SPME）手柄、DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supe1co公司；电加热磁力搅拌恒温夹套 无锡顺润公司；NaCl溶液（1 mg/mL） 山东佰鸿有限公司；癸酸乙酯 梯希爱化成工业发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官审评

建立5 人感官审评小组，3 男2 女，小组成员均具有国家中级评茶员及以上资质的专业人员。感官审评标准依照茶叶感官审评方法GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》冲泡[11]，主要对绿茶香气特征进行审评，审评顺序为热嗅香气、温嗅香气、冷嗅香气，具体方法：撮取3 g茶倒入审评杯内，用沸水（100℃）充至杯满（约150 mL）为止，浸泡4 min，随后将茶汤沥入审评碗内，闻其杯内香气，评其术语，判断香型。审评结果由审评小组一致通过获得，反复3 次，遵循少数服从多数原则，最后确定其香气类型。

1.3.2 样品前处理

称取10.0 g茶样放入250 mL三角瓶中，冲入100 ℃超纯水100 mL（物料比1∶10），加入1 mg/mL NaCl电解质溶液和癸酸乙酯作为内标物，用已打孔的橡皮塞（经丙酮浸泡12 h，去味）塞紧，磁力搅拌速率450 r/min，在60 ℃恒温夹套内搅拌加热，水浴平衡5 min后，将装有DVB/CAR/PDMS萃取头（实验前老化5 min）的SPME手持器透过瓶盖的橡皮塞插入自制顶空微萃取瓶，于茶汤液面上空吸附60 min，萃取完成后迅速将萃取头放入气相色谱-质谱联用仪进行热脱附解吸。

1.3.3 气相色谱-质谱条件

气相色谱条件：采用D B-5 M S毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），进样口温度：230 ℃，柱流速： 1 mL/min，不分流。程序升温参数：50 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升到230 ℃，保持2 min。

质谱条件：电子电离源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃，转接口温度280 ℃，电子倍增器电压350 V，质量扫描范围35～400 u。

1.3.4 定性分析

定性分析通过安捷伦自动质谱解卷积定性系统，解卷积参数峰宽设为20，分辨率、灵敏度及色谱峰形的要求均设为中等，匹配因子最小值设置为80，谱图检索NIST14，同时结合文献辅助定性。定量分析通过化学工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行计算，求出各组分的相对含量。质量控制：加入癸酸乙酯对整个萃取和检测过程进行监控，保证每个样品图中癸酸乙酯峰的保留时间变化率不超过1%，且峰面积变化率不超过10%。

计算各挥发物的保留指数（rentention index，RI），以正构烷烃混合物（C5～C26）为标准，在相同色谱条件下进行气相色谱-质谱联用分析并根据下式进行化合物的计算，与文献RI值进行比对。RI筛选标准为RIi±20，RIi为文献参考值。

式中：t’r（X）为待测化合物X的调整保留时间；t’r（Cn）为碳原子数为n的正构烷烃调整保留时间；t’r（Cn＋1） 为碳原子数为n＋1的正构烷烃调整保留时间；n为碳原 子数。

1.4 数据处理

SIMCA-P11.5（Umetrics，Sweden）用于PCA和PLSDA，IBM SPSS Statistics22用于HCA及比较香气挥发物之间的差异性。

2 结果与分析

2.1 3 种栗香特征绿茶香气成分分析和含量比较

表2 栗香绿茶中的挥发性化合物Table 2 Vlatile compounds in chestnut-like green tea samples

续表2

如表2所示，经过峰的筛选，去除柱流失和含卤族元素的化合物，样品共鉴定出85 个挥发性组分，主要包括醇类、芳香烃、醛类、酮类、烷烃类、萜烯类、酯类。其中烷烃类（19 种）种类最多，酮类（14 种）、萜烯类（11 种）次之，芳香烃类（4 种）最少。通过与文献进行对比，发现有12 种香气物质在栗香茶叶香气研究中被检测过[12-13]，包括3-蒈烯、芳樟醇、壬醛、水杨酸甲酯、2-甲基萘、茉莉酮、香叶基丙酮、（E）-β-紫罗兰酮、δ-杜松烯、去二氢菖蒲烯、橙花叔醇、（Z）-己酸-3-己烯酯。在85 个共同化合物中，3 种香型茶样相对含量较高的化合物（相对平均含量≥0.5%）主要有2,2,4,4-四甲基辛烷、（E）-3-丁酸己烯酯、2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛、十二烷、癸醛、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、1,2,3,4,4a,5-六氢-（1S,4S,-4aS）-1-异丙基-4,7-二甲基-萘、1,1,1-三甲基-1,2-二氢萘、（Z）-3-己酸己烯酯、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、茉莉酮、十四烷、 （E）-β-紫罗兰酮、2,4,6-三（1,1-二甲基乙基）-4-甲基环己-2,5-二烯-1-酮、去氢白菖烯、δ-杜松烯，这些成分对构成绿茶的特征风味有着重要的“基质”作用，是香气特征主体成分[13-14]。

已有研究中，栗香通常认为与热物理化学反应生成的吡嗪、吡咯类等焦糖香物质关联性大[3,15-16]。本实验检测出6 种吡咯、吡嗪类物质，分别是2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基-吡嗪、2-乙基-6-甲基-吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪、3-甲酰基-4,5-二甲基吡咯、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪，体现所选茶样的烘炒香风味。

图1 不同栗香绿茶化合物相对含量对比Fig. 1 Comparison of the relative content of each class of volatile components in different chestnut-like green tea samples

如图1所示，嫩栗香型绿茶萜烯类物质（14.52%）和醛类物质（5.56%）相对含量高于板栗香型绿茶，板栗香型绿茶醇类、芳香烃、酮类、烷烃类、酯类物质相对含量均高于嫩栗香型绿茶，而熟栗香型绿茶酯类物质相对含量达到59.54%，远远大于其余2 种香型，熟栗香在其余类物质含量均低于另外2 种香型。

（Z）-己酸-3-己烯酯和（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯2 种酯类物质，在熟栗香中相对含量分别达到22.50%和17.83%，远大于嫩栗香和板栗香中含量，从表2可以看出，2 种物质在3 种香型中差异显著。（Z）-己酸-3-己烯酯是绿茶常见的挥发性组分，呈现强烈弥散性梨香，对西湖龙井茶香气的形成有显著贡献[11]；（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯是一种食品用香料，具有强烈的透发青香，带有生梨果香的茎样气息。炒青茶杀青时间长，苯甲醇、香叶醇等高沸点成分及吡嗪、吡咯等焦糖香物质含量较高，通常具有栗香或清新的香气[16]，与此同时，高温作用使低沸点的物质进一步挥发，发生酯化反应，青叶醇与（Z）-3-己烯酸形成（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯，以芬芳的水果香参与形成茶香[17]。

2.2 多元统计分析

2.2.1 基于PCA对不同栗香特征绿茶的区分

图2 PCA得分图（A）和Hotelling T2分布图（B）Fig. 2 PCA score plot (A) and Hotelling T2 value range plot (B)

近年来，随着香气检测技术的发展和多元统计分析技术的普及，越来越多的统计分析方法应用于茶叶香型的化学识别[18-19]，香气指纹图谱的建立[20]，香气特征成分的研究[21]等方面。PCA是一种基于最大统计学距离投影的降维方法，使用少量的综合变量（主成分）来取代原先的复杂多变量从而能在最大程度保留数据原有信息的情况下，降低数据复杂度，并对数据进行可视化处理[22]。

利用全部栗香茶样香气组分的相对含量进行PCA，提取得到4个主成分，累计贡献率为61.4%，基本可以表征所涉及的化学成分信息。如图2A所示，3种不同栗香特征的绿茶样品具有明显的区域分布特征。由于PCA属于无监督分析模式，没有考虑样本类别信息，对嫩栗香和板栗香2 种比较近似的香型区分不太明显，但是18个样品在99% Hotelling T2置信区间内，没有发现“离群样本点”，如图2B所示，且有16个样品在95% Hotelling T2置信区间内，表现出明显的聚类趋势。

2.2.2 基于PLS-DA对不同栗香特征绿茶的区分

和PCA相似，PLS-DA也是基于降维的多维向量分析方法，但是可以预设分类，其优势是可以尽量去除未控制变量对数据分析的影响，进一步挖掘数据中的信息，同时可以量化特征化合物造成组分差异的程度[23-25]。

以鉴定的85 个挥发性组分含量为X变量（表2），以18 个绿茶样栗香特征为Y变量进行PLS-DA。由图3A可以看出，18 个栗香茶样根据其香气特征被明显区分， R2Y＝0.843，Q2＝0.694，说明该模型对3 种栗香特征绿茶具有良好的稳定性和较好的预测能力。将模型建立时定义的分类Y矩阵的变量随机排列200 次，得到随机的不同相应Q2值作为衡量模型是否过拟合的标准[26-27]。如图3B所示，R2＝0.424，Q2＝－0.318，Q2负值表明该PLS-DA模型可靠，未存在过拟合现象，可以用于各自类别的判别分析。

图3 PLS-DA得分图（A）和置换检验图（B）Fig. 3 Score plot of PLS-DA (A) and plot of permutation test (B)

2.2.3 重要香气组分分析

图4 PLS-DA因子载荷图（A）和VIP得分图（B）Fig. 4 Loading plot of PLS-DA (A) and VIP scores (B)

因子载荷图可以反映每一个变量在得分图上的贡献，分布越密集的变量对栗香分类的影响越小，反之，离密集区越远的变量对栗香分类的影响越大。从图4A可以看出，茉莉酮（No.70）、香叶醇（No.55）、3,6-二甲基-辛烷（No.56）、香叶基丙酮（No.74）、2-甲基萘（No.58）可作为嫩栗香型的特征挥发性组分；板栗香型与辛醛（No.10）、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛（No.41）、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯（No.32）和3-甲基-十一烷（No.39）的含量显著相关，可作为板栗香型的特征挥发性组分；2,6,10-三甲基-十二烷（No.66）、1-癸醇（No.44）、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯（No.68）、（Z）-正戊酸-3-己烯酯（No.52）、（E）-3-丁酸己烯酯（No.42）和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪（No.60）与熟栗香型绿茶距离更近，对熟栗香型有更好的辨别能力，可作为熟栗香型的特征组分。

变量投影重要性（variable important for the projection，VIP）可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献，通常认为VIP大于1.0表示在判别过程中具有重要作用。VIP值越大，变量在栗香绿茶不同香型间的差异越显著。由图4B可以看出，有38 个挥发物VIP大于1.0可作为区分3 种不同栗香特征绿茶的标志物，特别是癸烷（No.9）、2,2,4,6,6-五甲基-庚烷（No.4）、去二氢菖蒲烯（No.81）、茉莉酮（No.70）、δ-杜松烯（No.80）、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛（No.41）、（Z）-3-己酸己烯酯（No.67），其VIP大于1.4，在区分3 种不同栗香特征的绿茶时尤为重要。

2.2.4 基于HCA对不同栗香特征绿茶的区分

图5 不同风味栗香茶的聚类分析树状图Fig. 5 Dendrogram for chestnut-like green tea constructed using Ward’s linkage

如图5所示，3种栗香香型绿茶可以在聚类距离12处被清晰地分成3 个聚类，其中Cluster I为熟栗香的香型聚类，Cluster II、Cluster III分别为嫩栗香和板栗香的聚类。此外，嫩栗香和板栗香在约14的距离可以聚合成一个聚类，说明在3 种香型中嫩栗香和板栗香在香型距离中更近，相似度更高，这与审评小组在审评过程中的感官印象一致：嫩栗香和板栗香更像一种水煮板栗的香气特征，而熟栗香更接近高火香的茶香。在专业审评书籍上将板栗香和嫩栗香视为同一种香气，由此可见，聚类效果和感官辨识基本一致[4]。

3 讨 论

本实验用气相色谱-质谱联用结合多元统计分析技术实现对3 种不同栗香特征绿茶的有效识别。通过PCA提取4 个主成分，累计方差贡献率为61.4%，基本可以表征所涉及的化学成分信息。结果表明，3种不同栗香特征的绿茶样品具有明显的区域分布特征。PLS-DA中，18个栗香茶样根据其香气特征实现良好分离，R2Y＝0.843，Q2＝0.694，说明该模型对3 种栗香特征绿茶具有良好的稳定性和较好的预测能力；通过置换检验发现，R2＝0.424，Q2＝－0.318，表明该模型可靠。通过HCA，3种栗香香型绿茶可以在聚类距离12处被清晰地分成3 个聚类，其中板栗香型和嫩栗香型距离更接近，和人工感官结果相似。

茉莉酮、香叶醇、3,6-二甲基-辛烷、香叶基丙酮、2-甲基萘、对嫩栗香型有更好的辨别能力，可作为嫩栗香型的特征性组分；在以往研究中，茉莉酮、香叶醇、香叶基丙酮、（Z）-3-己酸己烯酯已经被多次论证为龙井茶特征风味物质[28]。茉莉酮呈茉莉花香，香叶基丙酮呈现果香、清香[14]，香叶醇具有蔷薇系温和的花香，香叶醇是绿茶中典型的风味物质，其含量与茶树的品种、加工方法、鲜叶老嫩有关[29]。

辛醛、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯和3-甲基-十一烷可作为板栗香型的特征性组分；辛醛在朱荫等[13]研究中也有出现，有研究证明，脂肪醛大多呈现浓烈的果香风味，还带些许面包气。

熟栗香型与2,6,10-三甲基-十二烷、1-癸醇、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、（Z）-3-己酸己烯酯、（E）-3-丁酸己烯酯和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪含量显著相关，可作为熟栗香型的特征性组分。酯类化合物大多呈现轻微果香，（Z）-己酸-3-己烯酯则呈现强烈的弥散性梨香，对西湖龙井的香气特征形成具有显著作用。萜烯类化合物是茶叶香气的重要组成部分，单萜及倍半萜大都带有浓郁的甜香、花香和木香，是各类茶的主要香气成分[30]。

综上可知，茉莉酮、香叶醇、香叶基丙酮、2-甲基萘可作为嫩栗香型的特征性组分，辛醛、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯可作为板栗香型的特征性组分，1-癸醇、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、（Z）-3-己酸己烯酯、（E）-3-丁酸己烯酯和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪可作为熟栗香型的特征性组分。

根据VIP大于1.0筛选出38 种对不同栗香绿茶进行有效区分的标志物，特别是癸烷、2,2,4,6,6-五甲基-庚烷、去二氢菖蒲烯、茉莉酮、δ-杜松烯、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（Z）-3-己酸己烯酯，其VIP大于1.4，而且这7 种物质存在显著差异（P＜0.05），因此这7 种物质在区分3 种不同栗香特征的绿茶过程中发挥着重要作用。

此外，大多数高含量的组分（相对平均含量≥0.5%）多集中于挥发性物质谱图的中后部，证明栗香香型绿茶挥发性物质大多为中高沸点的化合物，这与叶国柱等[31]的研究推断一致，在16 种相对高含量的共同化合物中，有4 种酯类、4 种烯类、3 种酮类、2 种醛类和3 种烷烃类，其中酯类物质的含量显著大于其他几类物质，相对含量达到31.26%，可推测，炒干过程中高温作用使低沸点的物质发生酯化反应，形成的大分子质量酯类，以及在加热水解条件下萜苷类发生环化、脱水、异构化释放的烯醇、烯醛、萜烯构成了栗香绿茶风味特征的主体物质。