乳酸片球菌AS1.2696来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质分析

郭双双，郑芳芳，可丛雪，王子龙，韦宇拓，黄日波，杜丽琴*

（广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，生命科学与技术学院，广西 南宁 530005）

鼠李糖苷酶以L-鼠李糖苷酶为主，L-鼠李糖苷酶又可分为α-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）和β-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.43）。α-L-鼠李糖苷酶可将α-鼠李糖苷键的非还原端水解[1]，可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α-1连接的糖苷键[2]，如柚皮苷[3-5]、新橙皮苷、柴胡皂苷C、橙皮苷[6]、芦丁[7]和槲皮苷等物质末端的α-L-鼠李糖基[8]。Lise等[9]从Novospingobium sp. PP1Y中得到一个对α-1,2、α-1,6均有较好水解效果的鼠李糖苷酶。

CAZY根据氨基酸序列的相似性和疏水簇分析，将α-L-鼠李糖苷酶划分为GH13、GH28、GH78和GH106家族[10]。目前报道较多的为GH78家族[10-13]，GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶大多来源于真菌（如曲霉属和青霉属等）[14]和细菌[15]。Ishikawa等[16]从Aspergillus oryzae中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶最适酶反应温度为70 ℃。来源于Aspergillus terreus的α-L-鼠李糖苷酶在温度为70 ℃时，仍具有较好的耐受性[17]。Li Lijun等[18]从Aspergillus niger JMU-TS528中发现1 株能够耐葡萄糖和乙醇的鼠李糖苷酶。Qian Siriguleng等[19]从新鲜牛肝中分离纯化分子质量大小为75 kDa的薯蓣皂苷-α-L-鼠李糖苷酶，该酶的最适酶反应pH值为7.0，最适温度为42 ℃，Mg2＋对该酶具有激活作用。Birgisson等[15]从一种新型嗜热细菌中克隆了2 个α-L-鼠李糖苷酶并进行重组表达，研究证明两个重组酶RhmA和RhmB的分子质量大小为104 kDa和107 kDa，当温度达到70 ℃时2 个重组酶均具有较好的耐受性，RhmA和RhmB对对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR）的Km分别为 0.46 mmol/L和0.66 mmol/L，Vmax分别为134 U/mg和352 U/mg。这两个α-L-鼠李糖苷酶还能够水解α-1,2和α-1,6连接的β-D-葡萄糖苷。

α-L-鼠李糖苷酶具有广泛的应用价值与前景。在食品饮料方面，α-L-鼠李糖苷酶可水解柚皮苷，用于饮料果汁的脱苦[20-21]，改善饮品的风味。在医药方面，通过水解柚皮苷来获得应用价值更广更好的普鲁宁[3,22-24]；异槲皮素作为芦丁水解掉一个末端鼠李糖的产物，其相较于芦丁具有更好的医疗效果和利用率[25]，如韩冰[26]、Gerstorferová[17]、Yadav[27]等分别得到中能够高效转化芦丁生成异槲皮素的重组菌株。其他水解活性的应用，α-L-鼠李糖苷酶还可应用于水解淫羊藿苷类物质，增加活性苷元的含量[28-29]。

本研究中乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）AS1.2696已经全基因组测序，通过对全基因组序列分析，查找到2 个注释为α-L-鼠李糖苷酶的基因序列。对这2 个基因序列进行比对，结果发现这两个基因序列的一致性为44.6%，编码蛋白质的序列一致性只有17.8%，一致性比较低，于是克隆表达菌株中的2 个α-L-鼠李糖苷酶基因，纯化目的蛋白，研究这2 个重组酶的酶学性质以及底物特异性，以期挖掘其在一些天然类底物的水解功能及潜在的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸片球菌AS1.2696由本实验室保藏。

限制性内切酶 大连宝生物工程有限公司；质粒DNA小量提取试剂盒 北京BioFlux公司；Ni-NTA填料德国Qiagen公司；pNPR、4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinoside，pNPA）等对硝基苯基底物美国Sigma公司；柚皮苷、新橙皮苷 阿拉丁生化科技股份有限公司；橙皮苷、芦丁 生工生物工程（上海）股份有限公司；淫羊藿苷类物质、槲皮苷、杨梅苷、柴胡皂苷C 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Biomertra T-Gradient Thermoblock聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 德国耶拿分析仪器股份公司；Centrifuge 5415D离心机 德国Eppendorf公司；G1314F-1260VWD高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent公司；ZHWY-211B恒温摇床 上海精宏实验设备有限公司；恒温培养箱 德国Binder公司；JY92-2D超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶基因prha2及prha3的克隆

从数据库中，查找到乳酸片球菌AS1.2696中含有2 个已经注释为鼠李糖苷酶的基因序列，分别将其命名为prha2及prha3。使用SMART软件分别对其编码的蛋白质结构组件进行分析，并使用SignalP4.1进行信号肽的预测。以pSE380为表达载体，设计含有6×His标签的引物，以乳酸片球菌AS1.2696的总DNA为模板，PCR扩增鼠李糖苷酶完整基因prha2及prha3。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，DNA测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

prha2基因扩增的引物：PA1-1：5’-ACGCCATGGA ACATCATCATCATCATCATATGGCATTTACATTTCA AATTAATG-3’（引入酶切位点NcoI，和组氨酸标签。加粗表示酶切位点，下划线表示组氨酸标签）；PA1-2：5’-GGCGAGCTCCTAACTTAAATACTTTCTCATTA AG-3’（引入酶切位点SacI）。

prha3基因扩增的引物：PA2-1：5’-ACGCCATGG AACATCATCATCATCATCATATGAATCAAACTTATT GGATCTG-3’（引入酶切位点NcoI，和组氨酸标签）；PA2-2：5’-GTCGAGCTCTCACGCAATGGGAATTACT ACGGPCR-3’（引入酶切位点SacI）。

反应程序：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，57.6 ℃、30 s，72 ℃、2 min，进行30 个循环；72 ℃、10 min。将PCR产物纯化并酶切处理后连接至经过同样酶切处理的pSE380表达载体，转化至大肠杆菌XL1-blue中经过测序。将成功构建的重组质粒分别命名为pSE-prha2、pSE-prha3。

1.3.2 重组酶PRHA2和PRHA3的诱导表达及纯化

将菌株于37 ℃培养，使菌液OD600nm达到0.4～0.6，再加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）进行诱导，在最佳诱导条件下进行诱导一定时间后，离心收集菌体。超声波破胞后，通过镍亲和层析纯化重组酶PRHA2和PRHA3。并对纯化后的重组酶进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.3.3 重组酶PRHA2和PRHA3酶学性质分析

鼠李糖苷酶酶活力单位（U）的定义：在最适酶反应条件下，每分钟催化1 μmol底物（pNPR）转化为产物对硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）所需要的酶量。酶活力测定方法：酶标准反应体系是由缓冲液、底物、酶液组成200 μL体系，170 μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、20 μL 10 mmol/L的pNPR先在最适酶反应温度下预热2 min，加入10 μL适当稀释的酶液，准确反应20 min后，加入50 μL 2 mol/L Na2CO3溶液终止酶反应。以不加酶的反应管为空白对照。混匀后取200 μL反应液至酶标板中，在405 nm波长下读取吸光度。

1.3.3.1 最适酶反应pH值的测定

在37 ℃条件下，测定不同pH值（3.0～8.0）的0.1 mol/L柠檬酸-0.2 mol/L磷酸氢二钠缓冲液对重组酶活力的影响，以最高活力为100%，计算在各个pH值下重组酶的相对活力，相对活力最高对应的pH值即为该酶的最适反应pH值。

1.3.3.2 最适酶反应温度的测定

在最适酶反应pH值条件下，测定酶在不同温度下（25～80 ℃）的酶活力，以最高活力为100%，计算各个温度下重组酶的相对活力，相对活力最高对应的温度即为该酶的最适反应温度。

1.3.3.3 重组酶的动力学常数测定

在最适酶反应条件下，测定酶在以0.1～9.0 mmol/L一系列不同浓度的pNPR为底物时的比活力，使用软件GraphPad Prism 5通过非线性回归分析拟合出重组酶的Km、Vmax值。

1.3.3.4 重组酶pH值稳定性的测定

将重组酶于4 ℃在一系列不同pH值的缓冲液中保存12 h，然后在最适反应条件下测定其残存酶活力，以保存在pH 7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中的纯酶活力为100%，计算各个pH值下重组酶的相对活力。

1.3.3.5 重组酶热稳定性的测定

将重组酶保存在一系列不同温度下1 h，立即取出放于冰上，在最适反应条件下测定其残存酶活力，以保存在冰箱4 ℃的纯酶活力为100%，计算各个温度下重组酶的相对活力。

1.3.3.6 化学试剂对酶活力的影响

在最适反应条件下，在反应体系中加入一定量的化学试剂（0.05 g/100 mL十二烷基硫酸钠、1%曲拉通（TritonX-100）、4 mol/L脲、0.01 mol/L咪唑、1%巯基乙醇、5%吐温-80），测定重组酶的残存酶活力。以不添加化学试剂的反应管酶活力为100%，计算各种化学试剂下酶的相对活力。

1.3.3.7 有机试剂对重组酶酶活力的影响

在最适反应条件下，在反应体系中分别添加体积分数5%～30%的醇类及有机溶剂（醇类：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、1,3-丙二醇；有机溶剂：二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四氢呋喃、吡啶、乙腈），测定重组酶的残存酶活力。以不添加有机试剂的反应管酶活力为100%，计算各有机试剂下酶的相对活力。

1.3.3.8 酶底物特异性的测定

人工底物：取合适的底物浓度，以及适当稀释的酶液，在最适反应条件下进行酶活力的测定。以pNP或oNP的生成量来计算酶活力，以pNPR作为底物时的酶活力为100%。测定的底物包括pNPR、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，oNPG）、4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenylβ-D-galactopyranoside，pNPGal）、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）、4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，α-pNPG）、对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX）、4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸（4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide，MU-Glc）、4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-2-Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside，pNPNAG）、4-硝基苯基-β-L-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinopyranoside，pNPA）、4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（4-nitrophenyl-β-D-cellobioside，pNPC）。

二糖及糖苷类：以终质量浓度为1 g/100 mL的乳糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖、苦杏仁苷、水杨苷分别作为底物，与纯酶在最适条件下反应测定酶活力。反应20 min后，煮沸终止5 min，利用葡萄糖氧化试剂盒测定反应管中葡萄糖的生成量，依次计算酶活力。

多糖类物质：以终质量浓度为1 g/100 mL的羧甲基纤维素钠、淀粉、蔗渣木聚糖、山毛榉木聚糖分别作为底物，与纯酶在最适条件下反应测定酶活力。反应6 h后，加入400 μL 3,5-二硝基水杨酸终止酶反应，煮沸反应管显色5 min。混匀后取200 μL反应液至酶标板中，于540 nm波长下读取吸光度。根据还原糖的生成量来计算酶活力。

其他底物特异性以终质量浓度为0.1 g/100 mL的柚皮苷、新橙皮苷、芦丁、橙皮苷、槲皮苷、杨梅苷、柴胡皂苷C分别作为底物，与纯酶在最适条件反应12 h后，煮沸终止5 min。用50%乙腈稀释10 倍，12 000 r/min离心30 min，取上清液利用HPLC分析反应产物。

对淫羊藿类物质的水解作用：以终质量浓度为100 μg/μL的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C分别作为底物，于纯酶在最适酶反应条件反应12 h后，煮沸终止5 min。用50%乙腈稀释3 倍，12 000 r/min离心30 min，取上清液利用HPLC分析反应产物。HPLC检测条件：安捷伦1260系列液相色谱仪，色谱柱：C18柱，进样量：10 μL，柱温：30 ℃，流速：1 mL/min，检测波长：270 nm。流动相：乙腈（A），水（B）。梯度洗脱：0～5 min，32% A；5～12 min，80% A；12～17 min，80% A；17～20 min，32% A；20～25 min，32% A。

1.3.4 重组酶的糖基转移活性的测定

糖类：以16 g/100 mL鼠李糖为鼠李糖基供体，20 g/100 mL的糖类或糖醇类为受体，加入重组酶反应12 h（PRHA2在55 ℃下反应，PRHA3在40 ℃下反应），煮沸5 min终止酶反应，12 000 r/min离心30 min，HPLC检测反应产物。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱：NH2柱；进样量：20 μL；流速：1 mL/min；流动相：70%乙腈，等度洗脱。

醇类：以16 g/100 mL鼠李糖为鼠李糖基供体，分别以10%的乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇，15%的甲醇和20%的乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、丙三醇为受体，加入重组酶反应12 h（PRHA2在55 ℃下反应，PRHA3在40 ℃下反应），煮沸5 min终止酶反应，12 000 r/min离心30 min， HPLC检测反应产物。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱：NH2柱；进样量：20 μL；流速：1 mL/min；流动相：83%乙腈，等度洗脱。

长链醇类：在重组酶的最适反应pH值条件下，以鼠李糖作为鼠李糖基供体，己醇、辛醇、壬醇、癸醇分别作为糖基受体，与纯酶在摇床220 r/min反应12 h后，煮沸终止5 min。12 000 r/min离心30 min，取有机相利用HPLC分析反应产物（体系：2.4 mL长链醇＋150 μL 40 g/100 mL的鼠李糖＋150 μL缓冲液＋150 μL酶液）。HPLC检测条件：蒸发光检测器；色谱柱：C18柱，进样量：20 μL，流速：0.8 mL/min；流动相：75%甲醇，等度洗脱。

烷基糖苷类：在重组酶的最适反应pH值条件下，以16 g/100 mL鼠李糖作为鼠李糖基供体，1 g/100 mL的己基-β-D-葡萄糖苷、庚基-β-D-葡萄糖苷、n-辛基-β-D-葡萄糖苷、壬基-β-D-葡萄糖苷、癸基-β-D-葡萄糖苷分别作为糖基受体，与纯酶反应12 h后，煮沸终止5 min。用超纯水分别稀释20 倍和100 倍，12 000 r/min离心30 min，取上清液利用HPLC分析反应产物。HPLC检测条件：蒸发光检测器；色谱柱：C18柱；进样量：20 μL；流速：0.8 mL/min；流动相：75%甲醇，等度洗脱。

咖啡酸：在重组酶的最适反应pH值条件下，以16 g/100 mL鼠李糖作为鼠李糖基供体，1 g/100 mL咖啡酸作为糖基受体，与纯酶反应12 h后，煮沸终止5 min。用50%乙腈稀释10 倍，12 000 r/min离心30 min，取上清液利用HPLC分析反应产物。HPLC检测条件：色谱柱：C18柱；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：327 nm；流动相：乙腈（A），2%乙酸溶液（B）；等度洗脱：A∶B=85∶15（V/V）。

苯甲酸：在重组酶的最适反应pH值条件下，以16 g/100 mL鼠李糖作为鼠李糖基供体，0.5 g/100 mL苯甲酸作为糖基受体，与纯酶反应12 h后，煮沸终止5 min。用50%乙腈稀释50 倍，12 000 r/min离心30 min，取上清液利用HPLC分析反应产物。HPLC检测条件：色谱柱：C18柱，进样量：10 μL；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；流动相：甲醇（A），20 mmol/L乙酸铵（B）；等度洗脱：A∶B=5∶95（V/V）。

1.4 数据及图像处理

重组酶的酶学性质数据采用GraphPad Prism 5进行处理，动力学常数使用软件GraphPad Prism 5通过非线性回归分析拟合出重组酶的Km、Vmax值。图像采用Microsoft Office Visio 2003进行处理。

2 结果与分析

2.1 AS1.2696中prha2及prha3鼠李糖苷酶基因的克隆

2.1.1 α-L-鼠李糖苷酶基因prha2及prha3的序列分析

图1 PRHA2和PRHA3的蛋白质结构组件及信号肽分析Fig. 1 Analysis of protein domains and signal peptide sequences in PRHA2 and PRHA3

本研究从实验室保存的1 株已经完成基因组测序的乳酸片球菌AS1.2696出发，分析其基因组数据，从中查找到两个被注释为α-L-鼠李糖苷酶的开放阅读框（open reading frame，ORF）。其中一个的ORF全长1 578 bp，由ATG起始TAG终止，编码了一个长度为525 个氨基酸的蛋白质。将该ORF命名为prha2，将其编码的蛋白质命名为PRHA2。对PRHA2的蛋白质结构组件进行SMART分析，PRHA2含有一个low complexity功能域和一个Bac_rhamnosid功能域（图1A）。同时，结合SignalP4.1进行信号肽分析，表明PRHA2不含信号肽序列（图1B）。对PRHA2进行理化参数的计算，结果显示PRHA2的理论分子质量为60 460.84 Da，理论等电点pI为5.05。

另一个ORF全长1 962 bp，由ATG起始TGA终止，编码了一个长度为653 个氨基酸的蛋白质。将该ORF命名为prha3，将其编码的蛋白质命名为PRHA3。对PRHA3的蛋白质结构组件进行SMART分析，PRHA3含有一个Bac_rhamnosid功能域（图1C）。同时，结合SignalP4.1分析信号肽，表明PRHA3不含信号肽序列（图1D）。对PRHA3进行理化参数的计算，结果显示PRHA3的理论分子质量为75 959.45 Da，理论等电点pI为6.10。

2.1.2 α-L-鼠李糖苷酶基因prha2及prha3的克隆和重组表达

图2 琼脂糖凝胶电泳分析Fig. 2 Agarose gel electrophoresis analysis

提取菌株乳酸片球菌AS1.2696的总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2A所示。以pSE380为表达载体，设计含有6×His标签的引物，以AS1.2696的总DNA为模板，PCR扩增基因prha2及prha3。电泳检测后，结果如图2B所示，分别成功扩增到一条约为1.5 kb及1.9 kb的DNA条带，片段大小与预期相符。

目的基因经用NcoI和SacI双酶切后与同样经NcoI和SacI双酶切的pSE380载体连接，构建重组质粒pSE-prha2及pSE-prha3。将连接产物转化大肠杆菌（Escherichia coli）XL1-Blue，提取质粒，用NcoI和SacI双酶切处理质粒。结果如图2C所示，重组质粒pSE-prha2及pSE-prha3双酶切后产生两条带，与预期大小相符，表明目的基因prha2及prha3已经连入载体pSE380。

2.1.3 重组酶PRHA2和PRHA3的诱导表达和纯化

图3 纯化产物的聚丙烯酰胺电泳分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified PRHA2 and PRHA3

由图3可知，相较于对照菌株，诱导后的重组菌株分别在预期大小处出现明显的蛋白质特征性条带，且纯化后的蛋白质溶液在相应位置也出现蛋白质特征性条带，表明成功表达且纯化到目的蛋白质PRHA2和PRHA3。纯化后的蛋白条带较为明显，可用于下一步的研究。

2.2 PRHA2和PRHA3基本酶学性质的鉴定

2.2.1 PRHA2和PRHA3最适反应pH值

结果表明，PRHA2的最适酶反应pH值为5.0（图4A），PRHA3的最适酶反应pH值为5.5（图4B）。

图4 pH值对PRHA2（A）和PRHA3（B）酶活力的影响Fig. 4 Effect of pH on the activity of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.2 PRHA2及PRHA3最适反应温度

结果表明，PRHA2的最适酶反应温度为60 ℃（图5A），PRHA3的最适酶反应温度为45 ℃（图5B）。

图5 温度对PRHA2（A）和PRHA3（B）酶活力的影响Fig. 5 Effect of temperature on the activity of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.3 PRHA2及PRHA3 pH值稳定性

在pH 5.5～8.0的缓冲液内4 ℃放置12 h后，重组酶PRHA2活力仍保持在80%以上，说明在此范围内该酶具有较好的pH值稳定性（图6A）；在pH 4.0～8.5的缓冲液内4 ℃放置12 h后，重组酶PRHA3活力仍保持在80%以上，说明在此范围内该酶具有较好的pH值稳定性（图6B）。

图6 PRHA2（A）和PRHA3（B）的pH值稳定性Fig. 6 pH stability of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.4 PRHA2及PRHA3温度稳定性

在温度25～45 ℃的温度范围保温1 h后，重组酶PRHA2活力仍保持在80%以上，说明在此范围内该酶具有较好的温度稳定性（图7A）。在25～35℃的温度范围保温1 h后，重组酶PRHA3活力仍保持在80%以上，说明在此范围内该酶具有较好的温度稳定性（图7B）。

图7 PRHA2（A）和PRHA3（B）热稳定性Fig. 7 Thermal stability of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.5 PRHA2及PRHA3的动力学常数

分别测定PRHA2（pH 5.0、60 ℃）及PRHA3（pH 5.5、45 ℃）在以0.1～9 mmol/L不同浓度的pNPR为底物时的酶活力（每个浓度做3 个重复）。利用软件GraphPad Prism 5通过非线性回归拟合出PRHA2的Km和Vmax值分别为（3.039±0.581）mmol/L和（2.032±0.186）μmol/（min·mg）（图8A）。PRHA3的Km和Vmax值分别为（2.797±0.132）mmol/L和（113.35±1.485）μmol/（min·mg）（图8B）。

图8 PRHA2（A）和PRHA3（B）的Km和Vmax值Fig. 8 Determination of Km and Vmax of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.6 化学试剂对PRHA2及PRHA3酶活力的影响

0.05 g/100 mL十二烷基硫酸钠和4 mol/L脲能够强烈抑制PRHA2，1% TritonX-100及0.01 mol/L 咪唑对PRHA2略有抑制作用，5%吐温-80和1%巯基乙醇对PRHA2有较强的抑制作用（图9A）。0.05 g/100 mL十二烷基硫酸钠和4 mol/L脲能够使PRHA3失活，1% TritonX-100对PRHA3酶活力影响不大，0.01 mol/L咪唑、5%吐温-80和1%巯基乙醇对PRHA3有不同程度的抑制作用（图9B）。

图9 化学试剂对PRHA2（A）和PRHA3（B）酶活力的影响Fig. 9 Effects of chemical reagents on the activity of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.7 有机试剂对PRHA2及PRHA3酶活力的影响

整体上看，各种有机试剂对PRHA2均有一定的抑制作用，且抑制程度与添加量相关，添加量越高，对PRHA2的抑制作用越强（图10A～C）。另外，乙二醇对PRHA2酶活力的抑制不强，在添加量为10%时仍保持有40%左右的酶活力；而其他几种有机试剂对PRHA2酶活力的抑制较为明显。随着有机溶剂的添加量增大，其对PRHA2的抑制作用越强，这几种有机溶剂对PRHA2有强烈的抑制作用。

整体上看，各种有机试剂对PRHA3均有一定的抑制作用，且抑制程度与添加量相关，添加量越高，对PRHA3的抑制作用越强（图10D～F）。另外，乙二醇及1,3-丙二醇对PRHA3酶活力的抑制不强，在添加量为20%时仍保持有40%左右的酶活力；而其他几种有机试剂对PRHA3酶活力的抑制较为明显。随着有机溶剂的添加量增大，其对RHA3的抑制作用越强且这几种有机溶剂对PRHA3的抑制作用较强。

图10 有机试剂对PRHA2及PRHA3酶活力的影响Fig. 10 Effects organic reagents on the activity of PRHA2 and PRHA3

2.2.8 PRHA2及PRHA3的底物特异性分析

从表1可以发现，PRHA2对pNPA有一定的水解活性，对其他芳香类糖苷底物及二糖底物没有活性或仅有微弱活性。PRHA3这些芳香类糖苷底物及二糖底物没有活性或仅有微弱活性。

表1 重组酶PRHA2及PRHA3的底物特异性Table 1 Substrate specificity of PRHA2 and PRHA3

2.2.9 其他底物水解特异性分析

表2结果表明，两种重组酶均只能水解橙皮苷及芦丁，这两种物质均为β-Glc-(6→1)-α-Rha糖苷键的物质。

表2 重组酶PRHA2和PRHA3的底物特异性Table 2 Substrate specificity of PRHA2 and PRHA3

2.2.10 重组酶对淫羊藿类物质的水解作用

从表3可看出，PRHA2对淫羊藿类物质均没有水解作用。PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用。值得注意的是，PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha外侧的鼠李糖糖苷键，即PRHA3能够水解以α-Rha(2→1)α-Rha外侧的鼠李糖糖苷键，但不能水解以β-Glc(2→1)-α-Rha外侧的鼠李糖糖苷键。

表3 重组酶PRHA2、PRHA3作用于淫羊藿类物质的底物特异性Table 3 Substrate specificity of PRHA2 and PRHA3 toward icariins

2.3 重组酶的糖基转移活性

以16 g/100 mL鼠李糖为鼠李糖基供体，HPLC分析转糖苷反应产物发现，PRHA2分别以葡萄糖、纤维二糖为受体的转糖苷反应产物中，检测到低含量的转糖苷产物。PRHA3分别以半乳糖、乳糖为受体的转糖苷反应产物中，检测到低含量的转糖苷产物。PRHA2在以鼠李糖为鼠李糖基供体，以己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷为受体的转糖苷反应产物中，检测到低含量的转糖苷产物，表明重组酶PRHA2对以上化合物具有转糖苷功能。PRHA2和PRHA3在以鼠李糖为鼠李糖基供体，各类短碳链的醇基糖醇类物质、长链醇类、咖啡酸、苯甲酸为受体的转糖苷反应产物中，均未检测到转糖苷产物。

3 结论与讨论

从乳酸片球菌AS1.2696中扩增得到2 个α-L-鼠李糖苷酶基因prha2和prha3，其基因大小分别为1 578 bp、1 962 bp，分别编码525 个和653 个氨基酸。以pSE380为表达载体在E. coliXL1-blue中表达目的基因，通过镍亲和层析纯化重组蛋白，测定重组酶的酶学性质。

PRHA2的最适pH值和最适温度分别为5.0和60 ℃；PRHA3的最适pH值和最适温度分别为5.5和45 ℃。两个重组酶的最适酶反应pH值均偏酸性，与大多数鼠李糖苷酶一致，酶的最适pH值为4～7，少数pH值大于7；最适酶反应温度差异较大，多数在40～60 ℃之间，少数在70 ℃或以上[1,17-18,27,30-34]。两个重组酶虽然来自同一个菌株，但其最适酶反应温度差异较大。PRHA2的Km值为（3.039±0.581）mmol/L，Vmax值为（2.032±0.186）μmol/（min·mg）；PRHA3的Km值为（2.797±0.132）mmol/L，Vmax值为（113.35±1.485）μmol/（min·mg）。各种化学试剂和有机试剂对两个重组酶均有不同程度的抑制作用。

对PRHA2和PRHA3的底物特异性进行研究，发现PRHA2和PRHA3不仅能够水解人工底物pNPR，还能够水解α-1,6键的天然底物橙皮苷、芦丁；PRHA3还能够水解朝藿定C。除此之外，重组酶还具有较弱的转糖苷功能，α-L-鼠李糖苷酶催化糖苷键的合成，在合成烷基糖苷、低聚寡糖等方面具有潜在的价值[35]。

橙皮苷在水中几乎不溶，水解橙皮苷，生成橙皮素葡萄糖苷和鼠李糖，而橙皮素葡萄糖苷是天然的甜味剂前体物。芦丁在药理作用和吸收效果等方面也不如其水解产物异槲皮素，本研究中，PRHA2和PRHA3对橙皮苷和芦丁具有较好的水解能力，两个重组酶对芦丁的催化效率高于橙皮苷，且PRHA3对芦丁和橙皮苷的催化效率高于PRHA2。

淫羊藿的主要成分包括黄酮类化合物、木脂素、生物碱、挥发油等，其中黄酮类化合物主要包括淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等。而PRHA3能够水解淫羊藿中的朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖，从而生成淫羊藿苷，目前尚鲜有文献报道有α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C制备淫羊藿苷。淫羊藿苷相较于朝藿定C更容易被人体吸收，而且淫羊藿苷及其进一步的水解产物在抗肿瘤方面具有重要作用[36]，其苷元脱水淫羊藿素目前已进入临床研究阶段。根据重组酶对淫羊藿类物质的水解结果发现，PRHA3能够水解以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖，但不能水解以β-Glc(2→1)-α-Rha连接的外侧的鼠李糖，可针对这一特点进一步研究PRHA3水解糖苷键的成键方式。

与其他糖苷酶相比，鼠李糖苷酶的分子结构及其功能了解仍有很多不足，本研究构建的2 个α-L-鼠李糖苷酶均来自乳酸片球菌AS1.2696，但重组酶PRHA2和PRHA3的基本酶学性质、底物特异性等各方面的差异均较大，丰富了α-L-鼠李糖苷酶的资源。