4 种香辛料提取物对猪肉肌原纤维蛋白抗氧化特性的影响

陈洪生，牛百慧，刘 欢，李艳青，张瑞红，孔保华*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉中最丰富的蛋白质，是肌纤维的重要组成部分。氧化会使蛋白更易发生热变性，并可导致蛋白的理化特性和功能特性下降[1-5]。在肉类工业中，通常使用天然的或合成的抗氧化剂控制肉制品中氧化反应的进程，但人工合成的抗氧化剂由于存在食品安全问题而受到了一定的限制[6-8]。本课题以猪肉MP为研究对象，在前期对14 种香辛料提取物抗氧化效果筛选的研究基础上，选择4 种抗氧化效果最好的提取物，即：丁香提取物（clove extract，CE）、迷迭香提取物（rosmary extract，RE）、桂皮提取物（cinnamon extract，CME）和甘草提取物（lcorice extract，LE）。分别添加不同质量浓度的香辛料提取物，然后采用羟自由基氧化体系，模拟肉本身或贮藏条件下存在的促进氧化的因素，对猪肉MP进行不同程度的氧化，通过分析羰基含量、巯基含量、Ca-ATP酶活性、溶解性和表面疏水性等指标的变化，明确香辛料提取物对MP氧化的控制作用，这对于肉品在贮藏或流通中通过抑制蛋白氧化来保持蛋白质的功能特性具有非常重要的意义[9-12]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪品种为三元猪，购于双汇肉业，宰后12 h内取背最长肌；香辛料 市购。

牛血清白蛋白、2,4-二硝基苯肼、5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、1,4-哌嗪二乙磺酸（1,4-piperazinebis(ethanesulp honic acid)，PIPES）、8-苯氨基-奈酚-磺酸（1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid，ANS）、Trolox（VE衍生物）（均为分析纯） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

N-1000型真空旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；T18 basic型高速匀浆机 德国IKA公司；Allegra 64R台式高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；SPECORD 200 PLUS紫外-可见分光光度计 德国耶拿分析仪器股份公司；F4500荧光分光光度计 日本日立有限公司；FD-1-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香辛料提取物的制备

参照Zhang Huiyun等[13]的提取方法。首先将购买的香辛料置于鼓风干燥箱中45 ℃烘干，然后经超微细粉碎机粉碎，准确称取50 g干粉置于500 mL烧瓶中，加400 mL 95%食用乙醇溶液与其充分混合，然后在55 ℃恒温摇床100 r/min振荡提取12 h，用Whatman No.2滤纸过滤，取下残渣加入200 mL食用乙醇再次提取12 h后再过滤。合并所有滤液后，在旋转蒸发仪中50 ℃浓缩，取出浓缩液40 ℃、0.07 MPa真空干燥24 h，最后将4 种香辛料提取物冷冻干燥，得到终产物为胶黏状半固体，保存于－20 ℃冰箱中备用。

1.3.2 猪肌肉蛋白质的提取

将猪背最长肌垂直于肌纤维方向切成50～100 g的肉片，根据Park等[14]的方法提取MP并稍作修改，提取液由10 mmol/L磷酸盐、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA组成，pH值为7.0，冷却至4 ℃后使用，洗液用0.1 mol/L NaCl溶液冷却至4 ℃后使用。MP的提取在4 ℃条件下完成，提取流程如图1所示。

图1 MP提取流程图Fig. 1 Flow chart of MP extraction

1.3.3 香辛料提取物的添加与MP的氧化

Fe-H2O2-抗坏血酸为羟自由基产生氧化系统，可以产生活性氧自由基，由FeCl3、抗坏血酸和H2O2通过铁的氧化还原反应而产生[15]。本实验采用10 µmol/L FeCl3、100 µmol/L抗坏血酸、10 mmol/L H2O2，作为MP的氧化体系；用含0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES缓冲液（pH 6.25）将提取的MP稀释为20 mg/mL，4 种香辛料提取物的添加量分别为0、0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL，然后使用氧化体系于4 ℃分别氧化0、1、3、5 h。最后通过添加PG-Trolox-EDTA-2Na（1 mmol/L）终止氧化反应。对照采用未加氧化剂，但含有PG-Trolox-EDTA-2Na的蛋白溶液。在各项指标测定中，使用含0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES缓冲液（pH 6.25）将蛋白稀释至相应的质量浓度进行测定。

1.3.4 羰基含量的测定

根据Chen Lin等[16]的方法稍作修改。取1 mL质量浓度为2 mg/mL的MP溶液置于塑料离心管中，每管中加入1 mL浓度为10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼溶液 ，室温条件下反应1 h，期间每5 min旋涡振荡1 次，然后添加1 mL 20%三氯乙酸溶液，10 000 r/min离心5 min，弃清液，用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）溶液清洗沉淀3 次除去未反应的试剂，加3 mL 6 mol/L的盐酸胍溶液，置于37 ℃水浴保温15 min以溶解沉淀，10 000 r/min离心3 min后除去不溶物质，所得物在370 nm波长处测吸光度。用22 000 L/（mol·cm）作为摩尔消光系数计算羰基含量，羰基含量表示为每克MP羰基物质的量（μmol/g）；蛋白含量用双缩脲法测定，用牛血清蛋白作标准曲线。

1.3.5 蛋白质Ca-ATP酶活性的测定

根据Wells[17]和Katoh[18]等的方法进行猪MP的Ca-ATP酶活性的测定，MP质量浓度为3.0 mg/mL，酶活性用每克蛋白中含有无机磷物质的量（mmol/g）表示。一系列浓度的磷酸二氢钠（0.0～1.0 mmol/L）作标准曲线计算磷酸盐含量。磷酸盐的标准曲线为Y=0.456X＋0.000 9，R2=0.999 5。

Ca-ATP酶活性的测定：取0.2 mL质量浓度为3.0 mg/mL 的MP溶液，加入2 mL Ca-ATPase反应液（7.6 mmol/L ATP、15 mmol/L CaCl2·2H2O、150 mmol/L KCl、180 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4），25 ℃反应10 min（20 ℃需反应25 min），然后加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，再于7 500 r/min离心5 min除去沉淀，取1.0 mL上清液加入3.0 mL 0.66%的钼酸铵（溶解于0.375 mol/L硫酸溶液中），充分混合后加入0.5 mL新配制的10% FeSO4溶液，反应2 min后，于700 nm波长处测定吸光度。

1.3.6 表面疏水性的测定

按照Chen Lin等[19]的方法并稍作改动。首先将制备好的MP样品分散在0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）中，配制成2 mg/mL的MP溶液，然后通过添加不同量的缓冲溶液，将每个样品分别稀释成0.1、0.5、1、5、10、15 mg/mL 6 个梯度，然后再取每个样品的不同质量浓度的稀释液4 mL与50 μL 8 mmol/L ANS溶液混合，最后以荧光强度为纵坐标，6 个质量浓度梯度为横坐标，所得曲线的斜率即为表面疏水性。

1.3.7 巯基含量的测定

根据Zhang Ziye等[20]的Ellman试剂法，测定蛋白质的巯基含量。取1 mL质量浓度为2 mg/mL的MP溶液与8 mL Tris-甘氨酸溶液（0.09 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L EDTA和8 mol/L尿素，pH 8.0）混合，充分混匀后加入1 mL Ellman’s试剂（每毫升含4 mg 5.5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）），置于黑暗处反应30 min后，于波长412 nm处测定吸光度，使用摩尔消光系数13 600 L/（mol·cm）计算巯基含量。对照组不加蛋白溶液，其他处理方法相同。

1.3.8 蛋白溶解性的测定

依据Benjakul等[21]的方法并稍作改动。称取猪MP 1 g溶解于18 mL 0.6 mol/L KCl溶液中，混合匀浆30 s，匀浆液在室温条件下搅拌溶解4 h，然后4 ℃、8 500×g冷冻离心30 min。取10 mL上清液溶解于冷的0.5 g/mL三氯乙酸溶液中，使最终体积分数为10%。离心所得沉淀物用0.1 g/mL的三氯乙酸溶液清洗后，溶解在0.5 mol/L NaOH溶液中。MP样品也直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中，作为总蛋白含量。最后用双缩脲法测定上清液中的蛋白含量。MP的溶解程度用溶解性表示，按下式计算：

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP羰基含量的影响

图2 不同质量浓度的4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP羰基含量的影响Fig. 2 Effects of different concentrations of four spice extracts on MP carbonyl content at different time points of oxidation

羰基的形成是蛋白质发生氧化的一项最显著的变化[22]。蛋白质侧链中含有NH2—或NH—基团，这些基团对氧化十分敏感，氧化后连接这些基团的碳原子上很容易形成羰基[23]。如图2A所示，未氧化肌肉的蛋白羰基含量为0.7 μmol/g，氧化5 h后羰基含量增加到2.4 μmol/g。CE的添加显著抑制了羰基的形成（P＜0.05），且随CE质量浓度的增加抗氧化作用明显增强。氧化5 h时，与对照组相比添加0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL CE组的羰基含量分别下降了16.04%、21.39%和44.07%（P＜0.05），添加RE组的羰基含量分别下降了8.28%、19.67%和23.80% （P＜0.05），添加CME组的羰基含量分别下降了4.56%、15.35%和18.67%（P＜0.05），添加LE组的羰基含量下降不显著（P＞0.05）。尽管其他3 种香辛料提取物也不同程度地抑制了羰基含量的增加，但CE的抑制效果最好，其次是RE和CME，因此对氧化引起羰基含量增加的控制能力为CE＞RE＞CME，LE的作用不显著。

2.2 4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP的Ca-ATP酶活性的影响

Ca-ATP酶活性的变化，突出显示了蛋白质氧化的物理和化学本质。Ca-ATPase酶活性与球蛋白头部的活性巯基紧密相关，且经常作为肌球蛋白完整性的指示器[24]。主要包括2 个活性巯基基团，SH1和SH2，即Cys707和Cys697，它们位于肌球蛋白头部催化域中一个较短的α-螺旋末端的对面[25]。这些基团的氧化修饰，通常会导致肌球蛋白S1的构象发生变化，影响了肌球蛋白S1和其底物的相互作用[26]。由图3可知，各组MP样品的Ca-ATP酶活性随氧化时间的延长均显著下降（P＜0.05）。未氧化MP的Ca-ATP酶活性为0.95 mmol/g，随着氧化的进行显著下降（P＜0.05），分别下降了40.35%（1 h）、58.63%（3 h）和81.22%（5 h）。CE和RE的添加显著地抑制了Ca-ATP酶活性的损失（P＜0.05），氧化1、3、5 h后，与未氧化样品相比较，添加1.0 mg/mL CE组中Ca-ATP酶活性分别下降了16.8%、19.0%和46.97%；添加1.0 mg/mL RE组分别下降了16.75%、23.56%和56.02%。而CME和LE的添加不但没有抑制Ca-ATP酶活性的损失，相反在一定程度上加速了Ca-ATP酶活性的损失。这可能是由于CME和LE提取物中的化学成分与MP样品中Ca-ATP酶活性部位的巯基相结合，改变了酶活性部位的结构，从而影响了酶的活性。因此CE和RE较好地控制了Ca-ATP酶活性的氧化损失，而CME和LE无积极作用。

图3 不同质量浓度的4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP Ca-ATP酶活性的影响Fig. 3 Effect of different concentrations of four spice extracts on MP Ca-ATPase activity at different time points of oxidation

2.3 4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP表面疏水性的影响

图4 不同质量浓度的4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP表面疏水性的影响Fig. 4 Effect of different concentrations of four spice extracts on MP surface hydrophobicity at different time points of oxidation

蛋白质的氧化会改变其天然的二级结构和三级结构，蛋白结构的氧化展开，使得蛋白溶液中疏水性基团的比例明显增加，从而增加了表面疏水性[27]。如图4所示，所有MP样品的表面疏水性均随氧化时间的延长而显著增加（P＜0.05）。4 种香辛料提取物都具有抑制表面疏水性增加的作用，且均随提取物添加量的增加而增强。与未添加香辛料提取物样品相比，氧化5 h时，添加0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL CE组的表面疏水性分别下降了6.84%、26.32%、33.53%；添加RE组的表面疏水性分别下降了2.78%、4.83%、12.74%；添加CME组的表面疏水性分别下降了6.13%、8.05%、15.08%；添加LE组的表面疏水性分别下降了6.88%、12.74%、15.08%。表明CE控制表面疏水性增加的效果最好，在较低的质量浓度（0.5 mg/mL）就能发挥很好的作用，显著地抑制了表面疏水性的增加（P＜0.05）。4 种香辛料提取物，控制表面疏水性增加的效果为：CE＞LE＞CME≈RE。

2.4 4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP巯基含量的影响

图5 不同质量浓度的4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP巯基含量的影响Fig. 5 Effects of different concentrations of four spice extracts on MP thiol group content at different time points of oxidation

巯基的损失通常被认为是二硫键形成的一个直接结果，也是一个很好描述肌肉中蛋白质氧化的指标[28]。如图5所示，所有样品的巯基含量均随氧化时间的延长而显著降低（P＜0.05），这说明氧化后的MP发生了二硫键的交联，使巯基含量下降，未氧化MP的巯基含量为52.6 nmol/mg，氧化后添加4 种提取物样品的巯基含量均显著降低（P＜0.05），提取物添加量为1.0 mg/mL，氧化5 h时，CE组巯基含量为17.6 nmol/mg，RE组为24.2 nmol/mg，CME组为29.5 nmol/mg，LE组为26.5 nmol/mg。因此，对巯基下降的抑制效果为CME＞LE＞RE＞CE。然而，相关研究发现巯基的损失不完全是氧化导致的二硫键交联所致，有一部分原因是由于巯基和多酚化合物发生作用，形成了巯基-醌加成物，从而也降低了巯基的含量[5,29-30]。Jongberg等[31]将富含多酚的白葡萄提取物添加到生牛肉饼中，采用高氧气调包装冷却贮藏，也得到了与本实验一致的结果。

2.5 4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP溶解性的影响

如图6所示，所有MP样品的溶解性均随氧化时间的延长而显著下降（P＜0.05）。未氧化MP样品的溶解度为74.06%，氧化1、3、5 h后分别下降到66.07%、54.67%和45.57%（P＜0.05）。氧化5 h时，添加0.1、0.5 mg/mL 和1.0 mg/mL CE组的溶解度分别为47.42%、50.92%和57.55%（P＜0.05），RE组的溶解度分别为47.15%、50.30%和54.00%（P＜0.05），LE组的溶解度分别为46.99%、47.50%和48.10%（P＜0.05），表明CE、RE和LE的添加显著抑制了氧化导致的MP溶解性降低，且CE的效果最好。相反，CME的添加，加速了蛋白溶解性的下降，这可能是由于CME提取物成分与蛋白质结合，从而加速了蛋白质的聚集，削弱了蛋白与水的相互作用。MP溶解性的下降主要是由于蛋白质侧链遭到自由基的氧化攻击形成了大量的羰基，同时蛋白质的结构伸展，使疏水基团外露，从而降低了蛋白质的溶解性[5,8]。蛋白羰基和表面疏水性的结果表明，CE和RE显著抑制这2 项指标的增加，从而有效地控制了蛋白溶解性的下降，这与本部分的测定结果相一致。对蛋白溶解性下降的控制作用为CE＞RE＞LE，CME无积极作用。

图6 不同质量浓度的4 种香辛料提取物对不同氧化时间MP溶解性的影响Fig. 6 Effect of different concentrations of four spice extracts on MP solubility at different time points of oxidation

3 结 论

4 种香辛料提取物对猪肉MP的抗氧化能力存在较大的差异，CE、RE和CME的添加显著抑制了蛋白羰基的形成（P＜0.05），对羰基含量的抑制能力为CE＞RE＞CME，LE的作用不显著；CE和RE对Ca-ATP酶活性下降具有显著的抑制作用（P＜0.05），CME和LE的无积极作用；4 种提取物控制表面疏水性增加的效果为CE＞LE＞CME≈RE；对蛋白溶解性下降的控制顺序为CE＞RE＞LE，CME无积极作用；提取物的添加均不同程度地加速了蛋白巯基的下降，这主要是由于巯基和多酚化合物发生作用，形成了巯基-醌加成物。综合以上抗氧化数据可以得出，CE和RE具有较好的抑制猪肉MP氧化的作用。今后还需进一步研究不同香辛料提取物与猪肉MP的作用机制，以及与巯基形成巯基-醌加成物的量化研究，从而明确多酚与蛋白的具体作用方式。