猪瘟的诊断方案及解决措施

刘照虎，曹 龙，马梓承，王宏宇，孟凡亮，刘思当，李宝全

（山东农业大学动物科技学院临床病理学实验室，山东 泰安 271018）

1 诊断

1.1 发病背景

该猪场为1 000头不同阶段育肥猪猪场，在4月初相邻的30日龄左右的育肥猪舍出现过猪瘟疫情的散发，采用猪瘟疫苗紧急免疫和药物控制等措施两周内止住了疫情。从4月中下旬开始在50至70日龄的育肥猪舍出现了疫情，发病率和死亡率超过50%。发病情况：50日龄病猪病程7 d左右，病猪耳尖及肢体末端的皮肤有大面积的出血，气喘呼吸困难，食欲减退消瘦腹泻，药物控制没有明显效果。猪场疫苗注射情况：2日龄猪伪狂犬病疫苗滴鼻，猪圆环疫苗14日龄首免，猪蓝耳病疫苗21日龄首免，猪瘟疫苗28日龄首免，35日龄免疫口蹄疫疫苗，在60日龄时再加强免疫一次猪瘟疫苗，但是疫情未见减轻迹象。

1.2 剖检病变

首先可见病猪耳部及臀部皮肤呈红紫色，尤其是四肢末端及猪耳尖的皮肤部分存在大面积出血；剖开可以直观从胸腔看到心耳密布出血点和心外膜有零散出血点分布，肺部表面有少量血斑存在；从腹腔可以看到脾脏淤血肿大且边缘梗死有丘疹状出血灶，肾脏为典型的 雀斑肾 密布针尖状大小的出血点，结肠壁淋巴小结肿胀，浆膜和黏膜广泛性出血，回盲瓣肿大充血和散布溃疡灶，膀胱里面积尿且膀胱壁上面存在大批出血灶；其他还有出现全身淋巴结出血肿大，切面大理石状，扁桃体散落化脓灶等。解剖病变如图1、图2、图3、图4。

1.3 制定确诊方案

从发病背景和剖检病变及本实验室调查的山东地区猪瘟疫病流行情况上看，初诊确定是猪瘟病毒感染。为了确诊是猪瘟和解决该问题制定了以下方案：首先PCR检测和病理组织学观察确定病原，病原检测检测项目为CSFVPRV gEPCVPRRSV。然后对免疫二次猪瘟疫苗的猪群（健康猪和非健康猪各10头）进行抗体检测以评价疫苗免疫效果，抗体检测项目为CSFVPRV gEPRRSV，最后进行综合分析。

图2 雀斑肾 肾脏上密布出血点

图3 心耳及心外膜有出血点

图4 全身淋巴结均见充血、出血、肿大

2 材料与方法

2.1 样品来源

样品来源与处理，2018年4月下旬，从山东省泰安市汶口地区1 000头育肥猪的中小规模猪场（仅育肥），采集血样20份和2份病料，血清分离6 000 r/min，离心5 min，病料取肝、肺、脾、肾、淋巴结等有眼观病变的部位加入PBS后研磨,9 000 r/min，离心3 min，置于-20 ℃冰箱冻存待检。血样采集来源为加强免疫后的发病育肥猪群中健康状况良好的和出现临床症状的猪只各10头。

2.2 主要仪器及试剂

DL 2 0 0 0 DNA M a r ke r、2hGC buffer、dNTP、rTaq 酶、ddH2O；Easy Pure Viral RNA/DNA Extraction kit；进口 MEDIAN 公司猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬gE抗体检测试剂盒，96孔血凝稀释板，Eppendorf 移液器，酶标仪等。

2.3 病原检测

处理过的病料组织-80 ℃反复冻融3次，4 ℃离心机3 000 r/min高速离心，然后取上清使用杭州睿博兴科DNA/RNA Extraction kit（批号：BSC67M1）提取病毒核酸。以提取的核酸作为模板，用猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒gE基因、猪蓝耳病病毒的鉴别引物进行PT-PCR扩增。将扩增后的PCR产物置于1%的凝胶琼脂中电泳，将电泳完的凝胶进行照胶。

2.4 病理组织学检查

将被剖检猪只新鲜的组织器官如脾脏、肾脏、淋巴结、心脏等，分别取有明显病变的厚度为硬币大小的组织块置于10%福尔马林溶液中固定，冲水，过酒精，包埋，石蜡切片，HE染色，镜检。

2.5 抗体检测

2.5.1 检测方法

严格按照试剂盒内所附说明书进行操作，置于450 nm波长下读数。

2.5.2 判定标准

PRRSV(猪蓝耳病病毒）：阳性判定标准为S/P值大于等于0.4；阴性判定标准为S/P值小于0.4；PRV gE（猪伪狂犬病野毒）：阳性判定标准为S/N值大于等于0.6；阴性判定标准为S/P值小于0.6；CSFV（猪瘟病毒）：阳性判定标准为阻断率大于40%；阴性判定标准为阻断率小于40%。

3 结果与分析

3.1 病原检查结果

用前面处理过的研磨液提取DNA/RNA后进行RT-PCR检测，结果为两份病料只有猪瘟病毒出现阳性条带，见图5。

图5 琼脂糖凝胶电泳结果

3.2 病理组织学结果

镜下观察结果为肝脏有大量淋巴坏死和肝脏淋巴坏死有嗜中性粒细胞浸润、脑有血栓和脑血管有 袖套 现象、心肌充血出血、 肾间质充血出血、肝门淋巴结出血性坏死等出血坏死性病变，符合猪瘟镜下病理变化特征。

3.3 抗体检测结果

根据临床表现将猪群分为非健康与健康(1号为非健康，2号为健康），对两个群体分别进行抗体检测，统计结果见表1。

统计结果可以得出健康猪群和非健康猪群的猪瘟抗体阳性率不高存在阴性猪只，抗体平均值只有40%多与国家的猪瘟免疫标准存在较大差距[2]。2个组的猪蓝耳病抗体阳性率分别为90%和100%，平均值分别为1.18和1.46，离散度稍微偏高，完全符合国家猪蓝耳病免疫标准。猪伪狂犬病阳性率为0，抗体平均值都在0.8以上，免疫效果很好，完全符合国家猪伪狂犬病免疫标准。说明猪瘟疫苗免疫操作或疫苗本身存在问题。

图6 心肌充血出血 H E，×400

图7 肾间质充血出血 H E，×400

图8 肝门淋巴结出血性坏死 H E，×400

图9 肝脏有大量淋巴坏死 H E，×400

表1 3种抗体检测统计表

4 结论

根据临床表现、剖检病变、病理组织学检查及病原学检查和血清学检测，最后诊断确定为猪瘟病毒感染。病原学检查猪瘟单一阳性，血清学检测猪蓝耳病和猪伪狂犬病抗体水平较好完全符合国家免疫标准。猪瘟疫苗免疫一般情况下，抗体水平达到较高水平可以为猪群提供足够保护力[3]，但本猪群在猪瘟疫苗二次免疫两周后的猪瘟抗体水平仍然较低，不能够为猪群提供应有的保护，造成猪群大量感染猪瘟病毒，继而出现高发病率、高死亡率。可以推测为猪瘟疫苗免疫效果不佳，另外也不能排除免疫抑制的情况。建议猪场将猪瘟疫苗送专业机构进行疫苗测评，同时可以将一小部分健康猪只紧急免疫另一种猪瘟疫苗，在饲料中添加恩诺沙星和维生素C等提高免疫力，加强饲养管理，严格消毒，防止继发感染其他病原。

猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒4类病毒目前仍是我国猪场最难应对的病原，这4类病毒一但在猪场流行就会造成大规模的伤亡，尤其中小规模猪场缺乏技术指导，在猪场暴发大规模流行病时，往往出现应对措施不足和找不到发病原因。所以本实验针对该类问题制定的诊断方案，通过3种检测方法严格验证了该猪场感染了猪瘟病毒，并且将问题根源锁定在免疫和疫苗方面。提供的诊断方案和解决措施也为出现该类情况的猪场提供了应对措施方面的参考。