人参根总皂苷对APAP诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用

李峰 包海鹰

摘 要 目的：探讨人参根总皂苷（GRS）对对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用。方法：建立APAP诱导小鼠急性肝损伤模型，设空白对照组， 模型对照组及GRS高、中、低剂量组，通过检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及肝脏匀浆中丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，并结合肝组织病理切片进行分析。结果：人参根皂苷各剂量组对APAP诱导的急性肝损伤小鼠均有保护作用，其中高剂量组最好。结论：其保护作用的机制可能与炎症、氧化应激及改善肝功能三个方面有关。

关键词 人参根总皂苷 对乙酰氨基酚 肝损伤

中图分类号：R282.71； R285.5 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）03-0055-05

Protective effects of ginseng root saponins on acute liver injury induced by APAP in mice*

LI Feng**， BAO Haiying***

（College of Chinese Medical Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the protective effects of ginseng root saponins on APAP-induced acute liver injury in mice. Methods： A mouse model of acute liver injury induced by APAP was established using acetaminophen. The mice were randomly assigned as a control group， a model group and GRS high， middle and low dose groups. The levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， alkaline phosphatase （ALP）， interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor a （TNF-α） in serum and malondialdehyde （MDA）， reduced glutathione （GSH）， and superoxide dismutase （SOD） in liver homogenate were determined and analyzed by combined with histopathological biopsy. Results： Ginseng root saponins have protective effects on APAP-induced acute liver injury in mice， in which the best results occurred in the high-dose group. Conclusion： Its protective mechanism may be related to three aspects including inflammation， oxidative stress and the improvement of liver function.

KEy WORDS ginseng root saponins； acetaminophen； liver injury

人參（Panax ginseng C. A. Mey）作为传统中药，其化学成分和药理活性方面的研究一直是中药领域的关注热点。人参化学成分复杂，目前人参中已经分离鉴定40余种人参皂苷单体，其次还含有人参多糖、氨基酸、蛋白质、人参二醇、人参三醇等有效成分。其中人参皂苷为主要活性成分之一，具有保护心功能，降血糖，抗氧化，抗疲劳，抗肿瘤等药理活性作用[1]。近年来的研究表明，人参皂苷在肝脏疾病如肝癌、肝纤维化、肝损伤和肝炎等，以及肝移植与肝脏切除中已经显现出一定的治疗作用。根据文献报道，人参皂苷在肝脏疾病中的作用机制较为复杂，主要是通过抗氧化、抗炎等作用来保护肝细胞和调节肝功能[2-4]。但在日常生活中，我们治疗肝脏疾病时，常常用护肝类等西药，虽然有疗效好，见效快等优点，但是长时间服用会带来抗药性和不良反应，而植物药的开发利用，具有整体和多靶点治疗作用，很少有不良反应和耐药性。因此植物药的开发利用趋势已经成为研究热点。

对乙酰氨基酚（APAP）是最常用的解热镇痛药，在治疗剂量时疗效显著，用药安全。但是在过量或其他特殊情况下APAP会给机体带来严重肝损伤的危险，甚至死亡，例如肝坏死、肝病变和肝硬化等肝脏方面的疾病。APAP使用过量所诱导的急性肝损伤导致美国每年近500人死亡，住院人数更多[5-6]；我国对此也引起高度重视。本文主要从抗炎、抗氧化、改善肝功能等方面阐述人参根总皂苷对APAP诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用，以便为植物药的开发利用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR雄性小鼠，SPF级，体重20.0～22.0 g。由长春生物制品研究所有限责任公司提供，许可批号：SCXK-（吉）2016-0008，实验前以常规方式进行适应性饲养1周。

1.2 药品、仪器及试剂

APAP购自吉林省金泰化玻有限公司；人参根总皂苷购自抚松县安东参业有限公司。

Shimadzu-AUY220型电子分析天平（日本岛津有限公司）；MCD-2000型高速离心机（Hsiangtai公司）；BX61光学显微镜（上海比目仪器公司）；石蜡切片机、组织摊片机和组织包埋机（德国Leica公司）；HH-W420型水浴箱（金坛市科析仪器有限公司）。

谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒购自南京建成科技有限公司；试剂盒白细胞介素1b（IL-1b）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）购自美国R&D;公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与处理

ICR小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组，模型对照组，GRS高剂量组，GRS中剂量组，GRS低剂量组。连续给药7 d，同期空白对照组每天灌胃等体积生理盐水。连续给药7 d后，除空白对照组以外，其余各组给药1 h后腹腔注射300 mg/kg的APAP。造模期间，禁食，不禁水。造模24 h后取血解剖进行样本处理。

1.3.2 样本处理

1）血清样本 小鼠眼球取血，收集血液后，离心10 min左右（3 000 r/min），将血清和红细胞迅速分离。

2）肝组织匀浆 切割标本后，称取重量。保持2～8 ℃的温度。以1∶9加入生理盐水，用匀浆器将标本匀浆充分。离心10 min左右（3 000 r/min）。仔细收集上清，置冰箱内藏备用。

3）苏木精-伊红（HE）染色 观察各组小鼠肝脏组织病理学改变，小鼠脊椎脱臼处死后，每次每组选取5只小鼠，迅速切取小鼠肝脏，用10%福尔马林固定24 h，标本按常规方法进行切片，厚度设为5 mm，经HE染色制作肾脏组织石蜡切片。

1.3.3 血清肝功能指标检测

依照试剂盒说明书按照试剂盒的测定指标，绘制标准曲线，获取各测定指标浓度，检测血清ALT、ALP及AST活性。

1.3.4 炎症因子指标检测

依照严格按照ELISA试剂盒说明书严格操作，检测血清中IL-1b和TNF-a水平。

1.3.5 氧化应激指标检测

取冻存的肝组织，制备组织匀浆，取上清液，严格按照剂盒说明书测定GSH、MDA的含量及SOD活性。

1.3.6 肾脏病理切片检测

经HE染色制作肾脏组织石蜡切片，于光学显微镜下观察肾脏病理学改变。

1.3.7 统计学处理

数据分析采用SPSS 23.0统计软件，计量组间比较采用单因素方法（ANOVA）进行统计分析；采用GraphPad Prism 6.0软件进行方差分析并作图。

2 结果与分析

2.1 对血清中ALT、AST、ALP的活性影响

与空白对照组小鼠比较，模型组小鼠的血清ALT、AST和ALP活性显著升高（P<0.01），说明小鼠急性肝损伤模型制备成功。与模型组小鼠比较，GRS高、中剂量组能显著降低小鼠血清中ALT、AST、ALP的活性，且存在一定的剂量效应关系（P<0.01），GRS低剂量组能够明显降低ALT、AST、ALP的活性（P<0.05），说明人参根总皂苷对APAP诱导的小鼠急性肝损伤具有降酶保肝作用（表1）。

2.2 对肝组织匀浆中MDA、GSH的含量及SOD的活性的影响

与空白组小鼠比较，模型组肝脏中的MDA的含量有显著升高（P<0.01），GSH的含量及SOD的活性显著降低（P<0.01）。与模型对照比较，GRS高剂量组能够显著使肝脏中MDA含量降低（P<0.01），使GSH的含量和SOD的活性显著升高（P<0.01）。GRS中剂量组能够明显使肝脏中的MDA含量降低（P<0.05），使GSH的含量明显升高（P<0.05），使SOD的活性显著升高（P<0.01）。GRS低剂量组能够使肝脏中的SOD活性明显升高（P<0.05），肝脏中的MDA及GSH的含量则无统计学意义。以上数据说明人参根皂苷能够提高肝组织抗氧化能力以及减缓APAP对肝细胞产生的脂质过氧化作用（表2）。

2.3 对血清中TNF-α、IL-1β的影响

与空白组小鼠比较，模型组小鼠的血清中TNF-a、IL-1b有显著升高（P<0.01），与模型组比较，GRS高剂量组TNF-a、IL-1b显著降低（P<0.01），GRS中、低剂量组TNF-a、IL-1b明显降低（P<0.05，图1）。

2.4 小鼠HE染色肝脏病理切片显微结构

空白對照组肝小叶边界清晰，肝细胞以中央静脉为中心，呈明显放射状形式排列，细胞形态良好。模型组组织结构破坏，肝细胞水样变性，细胞坏死，中央静脉淤血。有较多炎细胞浸润。GRS高、中、低剂量组，均在一定程度上可减轻组织病变范围与程度，使炎细胞浸润减少，但其效果均不如高剂量组（图2）。

3 讨论

药物性肝损伤是常见的药物副作用，当APAP给药剂量过大时，生成NAPQI过多，引起肝脏GSH耗损[7-8]。除此之外，APAP通过肝脏代谢产生的自由基能引发肝细胞膜脂质过氧化，但是在肝脏细胞的Ⅱ相代谢中，其包括解毒酶和抗氧化酶，是清除体内有害物质的重要途径[9]。

本研究中，APAP小鼠肝细胞存在一定程度的氧化应激损伤，给药剂量组能够显著降低MDA的浓度，提高GSH的含量，及SOD的活性，表明人参根皂苷能够提高肝组织抗氧化能力以及减缓APAP对肝细胞产生的脂质过氧化作用。

ALP存在机体的各个组织与器官中，其中以肝脏、骨骼和肾脏含量局多，正常血清中的ALP主要由成骨细胞产生，经血液流向肝脏，再从胆道系统排泄，当胆汁淤积性肝炎和肝外梗阻时ALP会明显升高。当肝脏受到损伤或者发生障碍时，反流入血也会而引起血清ALP升高[10]。而ALT主要存在于肝细胞浆内，当肝细胞受到损伤时，细胞内的转氨酶可会进入到血液中，从而引起血ALT升高。AST、g-GT、LDH也存在于肝细胞浆内，AST并分布于线粒体内，当肝细胞损害严重时，线粒体内AST释放入血，使血清AST升高大于ALT[11]。本研究证实，APAP模型组中，ALT、AST、ALP的水平均升高，而给药GRS高、中剂量组能够显著降低三种酶的水平，改善肝功能，人参根总皂苷对APAP诱导的小鼠急性肝损伤具有降酶保肝作用。

TNF-a在肝脏主要由激活的肝巨噬细胞产生，并作为重要的促炎因子和免疫调节因子参与各种肝脏疾病的发生与发展[12]，在人类肝病中起着至关作用。IL-1b是一种重要的炎症因子，近年来研究发现，一直在多种脏器损伤中起着重要作用[13]。本研究中，APAP模型组，TNF-a、IL-1b的水平显著升高，给药组能够降低 TNF-a、IL-1b的水平，说明人参根皂苷可以减轻APAP所致的肝损伤。本研究还证实，人参根总皂苷能够提高急性肝损伤小鼠肝组织抗氧化酶活力，减轻自由基对肝脏造成的的氧化损伤，与模型组比较能够降低ALT、AST、ALP三种酶的活性并且降低TNF-a、IL-1b炎症因子浓度。

综上所述，人参根皂苷对APAP致急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与炎症、氧化应激及改善肝功能三个方面有关。这为APAP诱导的小鼠急性肝损伤的深入研究及更好的临床应用提供一定的理论依据。

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