智利进口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因多态性及其对泌乳性能的影响

梁艳，倪炜，王梦琦，储双凤，杨章平，毛永江

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009）

乳蛋白约占乳中干物质的90%，是乳中重要的营养物质和主要的含氮物质，主要包括乳清蛋白和酪蛋白两大类。乳清蛋白包括α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、血清蛋白和少量免疫球蛋白，其中β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，包括αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）。Ashaffenburg等[1]研究证明β-乳球蛋白基因存在多态性，其多态性与泌乳性能、乳成分等方面的相关性引起人们的广泛关注，其后关于β-酪蛋白（β-CN）基因的多态性也有相继报道[2,3]。其中，β-乳球蛋白是反刍动物乳中主要乳清蛋白组分，占总乳糜的50%～60%。研究已确定编码牛乳中β-乳球蛋白的基因主要存在A、B两种等位基因，不同等位基因对产奶量和乳成分有不同的影响[4]。β-酪蛋白占总乳蛋白的30%，是人体氨基酸的重要来源，并能促进矿物质在人体内的消化及吸收，在一定程度上反映泌乳能力[5]，能够作为有效评估牛乳品质的指标之一[6]。近年来国内外对于乳蛋白基因多态性进行过多次报道，对不同乳蛋白基因多态性与生产性能的关联做了相关性研究[7～10]。研究表明，乳蛋白基因多态性与泌乳性能之间存在一定的关联。

近年来我国奶业发展迅速，除从新西兰、澳大利亚进口奶牛以外，2015年开始从智利引进。据不完全统计，2015年我国从智利进口奶牛共计22 817头，北京、山东、江苏等地均引进大批智利荷斯坦牛，占进口奶牛总数的14.89%[11]。2017年从智利进口9 628头，占全部进口奶牛总数的12.1%。江苏某大型奶牛场于2015年从智利引进荷斯坦牛6 000头，目前大部分已处于第二胎，具有完整的生产性能记录。本研究旨在利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析智利进口荷斯坦牛β-Lg和β-CN的基因多态性，同时探索其多态性对泌乳性能的影响，为标记辅助育种、提高智利进口荷斯坦牛的泌乳性能提供科学依据。

1 材料和方法

1．1 乳样采集及乳蛋白的分离

2017年10月于江苏某大型奶牛场随机选择健康的智利进口荷斯坦牛286头。在进行DHI检测采样时，每头牛采取混合均匀的奶样5mL，置于冰瓶保存并迅速带回实验室。室温下奶样解冻，4 000r/min离心10min，取出下层脱脂乳，其中1mL用于保存，剩余4mL奶样加入0.2mol/L乙酸和0.2mol/L乙酸钠各0.15mL，调pH值至4.6。4 000r/min离心8min，吸上层乳清于-40℃保存备用。下层酪蛋白沉淀用醋酸缓冲液（pH4.6）洗涤两次，每次4 000r/min离心8～10min，冻干于-20℃保存备用。

1．2 样品处理

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测样品β-Lg和β-CN基因的多态性，并用快速染色法进行染色，7%冰醋酸中保存[10]。

1．3 数据收集与整理

数据来自该采样牛场2016～2018年1～2胎采样牛只的DHI记录，主要包括牛号、采样时间、胎次、产犊日期、泌乳天数、日产奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、体细胞数、体细胞评分、尿素氮含量等信息。为保证结果的可靠性，数据不完整的记录不纳入分析，同时对DHI测定日记录进行了限定：泌乳时间为产后第5～365天，测定日产奶量为5～60kg，乳脂率为2%～7%，乳蛋白率为2%～6%，体细胞评分为0～9。经筛选，测定日记录数从原来的4 596条减少到最后3 185条。

1．4 统计分析

1.4.1 群体遗传分析

用SHEsis软件构建乳蛋白基因型单倍型，使用r2的方法进行连锁不平衡分析，其取值范围从0（连锁平衡）到1（完全连锁不平衡）。并用POPGEN（3.2）进行群体遗传统计分析，进行Hardy-Weinberg平衡检验，并计算基因频率和基因型频率、平均杂合度He和平均有效等位基因数Ne。

1.4.2 最小二乘模型

该模型为有一定固定效应且各因素间无互作的线性模型，模型如下：

式中，Yijklmno为泌乳性状的观察值；μ为总体均值；Yi为采样年度的固定效应；Sj为采样季节的固定效应；CSk为产犊季节的固定效应；Ll为泌乳阶段的固定效应；β-Lgm为β-Lg基因型的固定效应；β-CNn为β-CN基因型的固定效应；eijklmno为随机剩余效应。

在奶牛一个泌乳周期中，按泌乳时间可划分为4个阶段，产后5～100d为泌乳前期，产后101～200d为泌乳中期，产后201～305d为泌乳后期，产后306～365d为泌乳末期。按照当地气候特点，季节划分如下：春季为3～5月，夏季为6～8月，秋季为9～11月，冬季为12月到翌年2月。

所有数据用Excel录入，并用SPSS（Ver16.0）分析乳蛋白基因座对奶牛泌乳性能的影响。相同因素不同水平间多重比较采用Duncan’s法。

2 结果与分析

2．1 β-Lg和β-CN基因频率、基因型频率及遗传变异分析

智利进口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因型频率和基因频率值见表1。根据SHEsis软件分析可知，β-Lg和β-CN基因均呈多态性，其中β-Lg有A、B两种等位基因，基因频率分别为0.477和0.523，有AA、BB、AB三种基因型，优势基因型为AB型，频率为0.569。β-Lg基因平均杂合度（He）为0.496，平均有效等位基因数（Ne）为1.994。经χ2检验β-Lg基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

β-CN有A、B两种等位基因，基因频率分别为0.960和0.040，有AA和AB两种基因型，优势基因型为AA型，频率为0.920。β-CN基因平均杂合度（He）为0.077，平均有效等位基因数（Ne）为1.083。经χ2检验β-CN基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

β-Lg和β-CN多态基因座可构成4种单倍型（表2）。其中单倍型AA和BA的个体数最多，频率分别为0.520和0.457。AB和BB个体最少，频率分别为0.024和0.016。连锁分析表明：β-Lg和β-CN之间连锁不平衡系数为0.001，系数趋近于0，说明均处于连锁平衡状态。

表1 β-Lg和β-CN的基因型频率、基因频率及遗传变异分析

表2 β-Lg和β-CN基因两个位点的单倍型分析

2．2 β-Lg和β-CN多态性对智利进口荷斯坦牛泌乳性能的影响

用最小二乘模型分析各因素对荷斯坦牛泌乳性能的影响，结果由表3可知，β-Lg对日产奶量、乳蛋白率和SCS有极显著影响（P＜0.01），对乳脂率、脂蛋白比、相邻二次日产奶量差和相邻二次体细胞评分差影响不显著（P＞0.05）。多重比较分析表明：AB型个体日产奶量极显著高于AA、BB型（P＜0.01）；BB型个体的尿素氮含量极显著高于AA、AB型（P＜0.01）；AA、AB型个体的蛋白率和SCS极显著高于BB型（P＜0.01）。

β-CN对乳蛋白率和脂蛋白比有显著影响（P＜0.05）；对日产奶量有极显著影响（P＜0.01）；对乳脂率、SCS、尿素氮含量、相邻二次日产奶量差和相邻二次体细胞评分差影响不显著（P＞0.05）。多重分析表明：AB型个体的日产奶量极显著高于AA型（P＜0.01），脂蛋白比显著高于AA型（P＜0.05）；AA型个体的乳蛋白率显著高于AB型（P＜0.05）。

由表4可知，在非遗传因素方面，采样年度对日产奶量、SCS、尿素氮含量和相邻二次日产奶量差影响极显著（P＜0.01），对乳蛋白率和脂蛋白比影响显著（P＜0.05）；采样季节对日产奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、SCS、尿素氮含量和相邻二次日产奶量差影响极显著（P＜0.01）；产犊季节对日产奶量、乳脂率、乳蛋白率和脂蛋白比影响极显著（P＜0.01），对SCS影响显著（P＜0.05）；泌乳阶段对日产奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、SCS、尿素氮含量和相邻二次日产奶量差有极显著的影响（P＜0.01），对相邻二次体细胞评分差有显著影响（P＜0.05）；胎次对日产奶量影响极显著（P＜0.01），对相邻二次日产奶量差影响显著（P＜0.05）。

3 讨论

有研究表明，在不同牛品种间以及同一品种内不同地区群体间牛乳蛋白多态性存在一定的差异，如β-CN的B等位基因在麦洼牦牛中的基因频率为1.000，表现为单态[12]；κ-CN的B等位基因在娟姗牛中频率显著高于在荷斯坦牛中频率[13]。此外，Eenennaam等[13]对美国加州不同品种奶牛乳蛋白多态性的研究表明，娟姗牛β-Lg和β-CN的A基因频率分别为0.37和0.67，而荷斯坦牛相应的基因频率分别为0.43和0.98。陈宏宇等[7]的研究结果表明，β-Lg由A、B两种等位基因控制，基因频率均为0.5000；β-CN的A为优势等位基因，基因频率为0.9667。Auldist等[14]的研究发现，β-Lg的AA基因型控制表达的乳球蛋白比BB基因型表达的乳球蛋白高。可见，在不同地区以及不同品种间的牛乳蛋白基因频率分布存在差异，然而荷斯坦牛β-Lg的B等位基因频率在0.45～0.65之间，β-CN的A等位基因频率高于0.95，趋于固定。

表3 β-Lg和β-CN基因多态性对智利进口荷斯坦牛泌乳性能的影响

表4 利用最小二乘模型对智利进口荷斯坦牛泌乳性能进行方差分析的F值

本研究表明，β-Lg和β-CN基因多态性对日产奶量和乳成分含量有显著影响，与邢世宇等[10]、罗军等[15]、郭彦斌等[16]报道的结果一致。Dario研究发现β-Lg基因的多态性与乳蛋白率有密切关系[17]，影响牛乳产量和蛋白质含量[18]，这一点与本研究一致。研究结果进一步表明，β-Lg和β-CN对于日产奶量的影响极显著，其中β-Lg的AA基因型为影响日产奶量的优势基因型，而邢世宇等[10]指出澳系荷斯坦牛β-Lg的AB基因型为影响日产奶量的优势基因型，造成这些差异的原因可能是不同遗传背景下β-Lg基因座的遗传效应不一致。罗军等[15]研究表明β-CN对乳脂率有显著影响，郭彦斌等[16]研究表明β-CN对乳脂率、乳蛋白率均有显著影响，而本研究表明β-CN对乳蛋白率的影响显著，对乳脂率的影响不显著。造成这些不一致的原因可能是乳蛋白各遗传座位基因间的组合效应，如β-Lg基因通过与酪蛋白基因组合或相互作用，从而影响乳蛋白的含量[19]。邢世宇等[10]的研究表明β-Lg对SCS、尿素氮含量的影响不显著，而本研究结果表明β-Lg对SCS、尿素氮含量的影响极显著，造成这些差异的原因可能是不同环境中乳蛋白基因座对泌乳性状的影响不一致。本研究对β-Lg、β-CN对相邻二次日产量差和相邻二次体细胞评分差的影响也进行了研究，结果均为不显著。相邻二次日产奶量差和相邻二次体细胞评分差分别反映奶牛泌乳持续能力和体细胞数的变化情况，在奶业生产中有重要意义，但这方面的研究国内外均较少。影响奶牛泌乳性能的因素较多，如采样年度、采样季节、产犊季节、泌乳阶段和胎次等非遗传因素[20]，其对泌乳性能的影响也较大，这就要求在实践生产中不仅要重视遗传因素，也要重视非遗传因素对生产性状的影响。

4 结论

从本研究结果可知，智利进口荷斯坦牛β-Lg有A、B两种等位基因，有AA、AB、BB三种基因型，对日产奶量、乳蛋白率、SCS和尿素氮含量均有极显著影响；β-CN有A、B两种等位基因，有AA和AB两种基因型，对乳蛋白率和脂蛋白比有显著影响，对日产奶量影响极显著。该结果为智利进口荷斯坦牛早期选择和泌乳性能的提高提供了参考依据。