奶牛结核病检测技术临床研究

宋之波，侯引绪，郭江鹏

(1.山东畜牧兽医职业学院，潍坊 261000；2.北京农业职业学院，北京 102442；3.北京市畜牧总站，北京 100101 )

奶牛结核病是一种人畜共患的慢性消耗性传染病，该病严重威胁食品安全和人体健康，严重影响畜产品国际贸易，被《中华人民共和国动物防疫法》列为二类动物传染病。1949年以来，我国对该病采取了一系列严格有效的检疫、净化、防控措施，获得了良好效果。目前，该病已成为我国所有奶牛场必须检测、净化的一种疫病。

随着我国奶牛养殖业的发展，规模化奶牛场的养殖数量和存栏量迅速增加，100头以上规模牛场已经成为奶牛养殖的主体，万头牛场也不在少数。在这种情况下，牛场的牛结核病检测工作压力正逐步加大，尤其是大型牛场、万头牛场，一年两次例行的检疫、净化，工作量甚巨。因此，牛场迫切需要更快捷、更准确、适用不同规模的牛结核检测方法，以简化程序、提高检测质量、提高效率。

本研究采用PPD颈部皮内变态反应方法、牛结核病PPD尾根腹面皮内变态反应检测方法、γ-干扰素ELISA方法在规模牛场进行了牛结核病检测，并对测定结果进行了对比分析，以供参考。

1 材料

1．1 试剂

牛型提纯结核菌素（PPD），购自中国兽医药品监察所；γ-干扰素ELISA试剂检测试剂盒，购自青岛瑞尔生物技术有限公司。

1．2 试验动物

试验时间为2017年10月至2018年6月，先后在北京市规模化奶牛场及华北某大型奶牛场，随机选择1～4胎的荷斯坦成乳牛（不包括分娩0～4周的奶牛）为试验牛，共计8 000头，结合春秋季牛场结核检疫工作同时进行。

1．3 试验分组

在8 000头试验牛中随机选择6 000头，用PPD颈部皮内变态反应方法进行结核病检测；其余2 000头用牛结核病PPD尾根腹面皮内变态反应方法进行结核病检测；再对PPD皮内反应检出的阳性反应牛、可疑牛和在颈部皮内变态反应组随机选择的阴性牛2 000头，用γ-干扰素ELISA方法进行重复检测。

2 试验方法

2．1 PPD颈部皮内变态反应检测方法

2.1.1 结核菌素稀释及用量

将牛型提纯结核菌素冻干制品用注射用水（或生理盐水）稀释至10万IU/mL，每头牛皮内注射0.1mL。

2.1.2 检测部位及处理

PPD注射及检测部位为牛颈中上部，具体部位见图1。检疫部位提前1天除毛（剃毛用剃头刀或电动剃毛具），除毛范围直径一般为10cm。

图1 牛结核检疫颈部位置

2.1.3 测皮厚

除毛后将皮肤捏提成一双层皱褶，用游标卡尺测量皮厚，并做好记录。

2.1.4 牛提纯结核菌素（PPD）注射及皮厚测量

用酒精棉球对注射部位进行擦拭后，一律皮内注射0.1mL牛提纯结核菌素，注射部位鼓起一小包表明注射成功。如果在注射过程中出现“打飞针”问题，需重新补注1次。

皮内注射后72h，用游标卡尺测量皮厚，并观察结果；注射前后的皮厚测量由同一人完成。

2.1.5 判定标准

注射部位出现明显的红、肿者判定为阳性（+）；注射部位2次皮厚差大于4mm者判定为阳性（+）；注射部位2次皮厚差在2.1～3.9mm间者判定为可疑（±）；注射部位无任何反应或皮厚差在2mm以下为阴性（-）。

2．2 PPD尾根腹面皮内变态反应方法

2.2.1 检测部位及方法

选择牛尾根腹面中线（或中褶）左侧或右侧尾腹面皮肤处作为注射检测部位，用酒精棉球消毒注射点。一手捏起尾根部中褶皮肤，将注射器针头刺入一侧皮肤皮内，注入0.1mL10万IU/mL的提纯结核菌素，皮肤内形成豌豆大小的凸起，表明注射成功。

2.2.2 判定标准

注射72h后进行结果判定。在注射部位出现触诊或明显可视的肿胀变化，或尾中褶厚度≥8mm，或尾褶厚度与对侧比较厚度差≥4mm， 则判定为阳性（+）。

尾褶厚度与对侧比较，厚度差在2.1～3.9mm判定为可疑（±） 。

尾褶厚度与对侧比较，厚度差小于2mm者判定为阴性（-）。

2．3 γ-干扰素ELISA方法

2.3.1 检测方法

试剂配制、材料选择及检测步骤全部按γ-干扰素ELISA试剂盒说明书上的要求和操作注意事项执行。

2.3.2 判定标准

只有当结果满足阳性对照OD值＞0.700、阴性对照OD值＜0.150条件时试验有效；

阳性：牛PPD的OD值-PBS的OD值≥0.1；

阴性：牛PPD的OD值-PBS的OD值＜0.1；

重复孔OD值的计算需取平均值。

3 结果与分析

3．1 PPD颈部皮内变态反应检测结果

由表1可知，PPD颈部皮内变态反应检测结果为：阴性5 972头，占99.53%，阳性21头占0.35%，可疑7头，占0.12%。

表1 PPD颈部皮内变态反应法检测结果

3．2 PPD尾根腹面皮内变态反应法测定结果

由表2可知，PPD尾根腹面皮内变态反应法测定结果：阴性1 990头，占99.50%，阳性8头，占0.40%，可疑5头，占0.10%。

表2 PPD尾根腹面皮内变态反应法测定结果

3．3 γ-干扰素EISA方法牛结核病检测结果

由表3可知，PPD颈部皮内检测组随机选出的2 000头阴性牛用γ-干扰素ELISA方法检测的结果为：阴性1 895头，占99.45%，阳性9头，占0.40%，可疑2头，占0.10%。

由表4可知，利用γ-干扰素ELISA方法重复检测PPD颈部皮内变态反应阳性、可疑牛，结果为阳性24头，可疑4头。其中PPD颈部法的7头可疑牛有3头转为阳性。

表3 γ-干扰素ELISA方法牛结核病检测结果

表4 利用 γ-干扰素ELISA方法对PPD颈部皮内变态反应阳性、可疑牛重复检测结果

4 讨论

本试验所选择的奶牛主要来源于大型规模化奶牛场，用PPD颈部皮内变态反应法、PPD尾根腹面皮内变态反应法、γ-干扰素ELISA方法检测所得的平均阳性率为0.40%，可疑的比例为0.11%，说明我国大型规模化奶牛场在结核病的防控和净化工作上取得了较好效果[1]。

在群体阴性牛比例、阳性牛比例、可疑牛比例指标上，PPD颈部皮内变态反应法测定结果与尾根腹面皮内变态反应法测定结果基本一致，均可以反映群体结核感染率。PPD颈部皮内变态反应法测定结果与γ-干扰素ELISA方法检测结果差异也不大；对于阳性牛的检测，γ-干扰素ELISA方法重复检测结果与PPD颈部皮内变态反应法检测结果一致；但对于PPD颈部皮内变态反应检测结果为可疑的7头牛的复检，其中3头的γ-干扰素ELISA检测结果为阳性。这从一定程度上表明，γ-干扰素ELISA方法的敏感性要高于PPD颈部皮内变态反应[2]。

PPD颈部皮内变态反应法是国家检测结核病的法定方法，与尾根腹面皮内变态反应法相比，该法的保定、除毛工作强度较大其结果判定（肉眼观察和量皮）易受人为因素影响[3]。而PPD尾根腹面皮内变态反应法则保定相对容易，结果判定也相对容易、方便，受人为因素影响相对较少。PPD颈部皮内变态反应法更适用于中小型牛场，PPD尾根腹面皮内变态反应法更适合大型规模化牛场。γ-干扰素ELISA方法的优点是省时、省力、结果判定容易，缺点是成本较高，需要有专业的化验人员和化验条件，更适合在大型规范化牛场及效益高的万头牛场应用。