中药对猪场常见病原菌的药敏特性及联合抑菌活性评价

姜源明，俸祥仁，兰宗宝，陈德元，赵 武，刘 伟，银慧慧，孙建华

(1.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；2.广西南宁强微农牧科技有限公司，广西 南宁 530001；3.广西百朋种畜场，广西 柳州 541502；4.广西农业科学院 农业科技信息研究所，广西 南宁 530007)

随着现代化社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们对畜禽产品的质量安全要求越来越高，但这与养殖业中滥用抗生素的现象存在较大矛盾。为了防治动物疾病，畜牧养殖业中不可避免地使用抗生素，但仍然难以抵御各种传染病和新疾病的干扰，尤其是某些病原菌产生耐药性后，养殖户通常加大用药剂量或频繁更换药物，致使畜禽产品中的药残超标，给畜禽产品质量安全和公共卫生安全带来了风险隐患[1]。中药是天然药物，具有毒副作用小且不易产生抗药性的优点，是中华民族从无数应用实践中筛选并确定对动物有益无害的外源性精华物质，其组成成分可分为2大类[2]：(1)营养成分，如淀粉、蛋白、氨基酸、纤维素、脂肪、维生素等；(2)活性成分，如多糖、低聚糖、生物碱、甙类、酶类、有机醇、鞣质、多酚类、色素和挥发油等。为了提升畜禽养殖行业的健康发展，满足市场对供应安全畜禽产品的需求，中药在畜禽养殖业中的应用越来越广泛[3]，主要通过饮水、饲喂、饲料添加或药物注射等途径用于实际生产，既可预防和治疗疾病，又能促进动物生长，且不会因药物在肉、蛋、奶等畜禽产品中残留而危害人体健康[4]。为此，本研究通过药敏试验筛选出能有效防治猪场常见病原菌的单味中药，并测定了中药两两组合联用的抑菌活性，根据联合抑菌指数(FICI)评价了其联合效应，旨在为推进中药在畜牧业中的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大肠杆菌(Escherichiacoli)、巴氏杆菌(Pasteurellasp.)、链球菌(Streptococcussp.)、沙门氏菌(Salmonellasp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和放线杆菌(Actinobacillussp.)等猪场常见病原菌由广西兽医研究所筛选获得，使用前将保存于斜面培养基上的菌种接种至适宜的营养肉汤中，37 ℃培养16～18 h，然后放入4 ℃冰箱保存备用。乌梅、大黄、桂枝、黄芩、秦皮、板蓝根、穿心莲、决明子、黄柏、蒲公英、知母、栀子、黄连、金银花、大青叶、紫花地丁、龙胆草、白头翁、败酱草、牡丹皮、夏枯草、苦参、土茯苓、青蒿、连翘、野菊花、石斛、杜仲、柴胡、诃子、白鲜皮、茵陈、虎杖、鱼腥草、桑叶、甘草、大青叶、黄芪、地榆、半枝莲、赤芍、白术、防风、党参、石榴皮、白扁豆、凤尾草、马齿苋、五倍子等中药饮片购自广西玉林市中药材专业市场，醡浆草采摘于广西药用植物园。营养琼脂培养基、营养肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试验药材的处理

醡浆草于清晨采摘新鲜原草，以研钵将原草研碎后用纱布过滤，收集滤液置于离心管中，4000 r/min离心20 min，取上清液浓缩，装瓶备用。准确称取乌梅、大黄、黄芩、秦皮、板蓝根、黄柏、蒲公英、知母、栀子、黄连、金银花、大青叶、紫花地丁、龙胆草、白头翁、败酱草、牡丹皮、夏枯草、苦参、土茯苓、仙鹤草、连翘、野菊花、石斛、杜仲、柴胡、诃子、白鲜皮、茵陈、虎杖、桑叶、甘草、大青叶、黄芪、地榆、半枝莲、赤芍、白术、防风、党参、石榴皮、白扁豆、凤尾草、马齿苋、五倍子各50.0 g，置于煎煮容器内，加入5～7倍蒸馏水浸泡1～2 h，煎煮30 min后收集药液，药渣再加入3～5倍蒸馏水继续煎煮20 min，合并2次药液后浓缩至生药含量为1.0 g/mL，4000 r/min离心20 min，取上清液装瓶备用。穿心莲、桂枝、决明子、金银花和鱼腥草用适量的95%乙醇浸泡6～8 h，收集浸提液，药渣再用95%乙醇浸泡4～6 h，合并浸提液后于80 ℃加热回流1.5～2.0 h，收集浸提液，过滤，浓缩至生药含量1.0 g/mL，装瓶备用。全部药液需经121 ℃灭菌15～20 min，取出冷却后置于4 ℃下保存备用。

1.3 药敏试验

以无菌棉签蘸取目标菌液均匀涂布在营养琼脂培养基表面，用直径6 mm的打孔器在培养基上等距离打孔6个，每孔加入中药提取液0.2 mL，每种药液设3个平行，置于37 ℃培养箱中培养18～24 h，测量抑菌圈直径。体外抑菌定性结果判定标准：抑菌圈直径小于10.00 mm为耐药(不敏感)，10.00～15.00 mm为中度敏感，15.00 mm以上为高度敏感。

1.4 药物最小抑菌浓度(MIC)试验

采用试管二倍稀释法：(1)取11支带有灭菌棉塞的试管，编号后排列在试管架上。向每支试管中加入无菌营养肉汤培养基2.0 mL，然后在第1支试管中加入灭菌的中药药液2.0 mL，混匀后取出2.0 mL放入第2支试管中，以此类推，直到第9支试管取出2.0 mL弃除，即配成含中药提取物分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等梯度浓度的药液(表1)。第10支试管不加任何药物作为对照，以观察培养基是否适合于菌株生长。第11支试管加受试中药药液2.0 mL，混匀后弃除2.0 mL，不接种菌株，以观察受试中药是否受污染。(2)将营养肉汤培养6～8 h的菌液用无菌营养肉汤进行1000倍液稀释，然后取0.1 mL菌液分别加入到第1～10支试管中，混匀，37 ℃培养16～24 h后观察结果。若肉汤混浊，表示细菌生长；若肉汤完全清亮，表示无细菌生长。(3)将未见细菌生长的营养肉汤转种到营养琼脂培养基上，仍无细菌生长，即该试管对应的药量就是受试中药的最小抑菌浓度(MIC)。

表1 中药提取物抑菌浓度与对应的药物稀释倍数关系

1.5 联合用药效果评价

以大肠杆菌为供试菌株，采用微量棋盘稀释法对中药两两组合进行二倍倍比稀释，药物互作效应通过计算其部分抑菌浓度指数(FICI)来判断，具体操作及判定标准参照NCCLS[5-6]。

FICI=MICA联/MICA+MICB联/MICB

其中，A表示抗菌药，B表示原儿茶酸或绿原酸。判定标准：FICI≤0.50表现为协同作用，0.50

2 结果与分析

2.1 药敏试验结果

由表2可知，乌梅、大黄、黄芩、金银花、连翘、野菊花和五倍子对大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和放线杆菌等6种猪场常见病原菌均表现为高度敏感；桂枝、板蓝根、诃子和鱼腥草对6种猪场常见病原菌具有抑菌作用，或呈高度敏感，或呈中度敏感；蒲公英、知母、败酱草、仙鹤草、石斛、柴胡、白鲜皮、桑叶、地榆、半枝莲、防风和白扁豆对6种猪场常见病原菌呈耐药性；其余中药对6种猪场常见病原菌的抑菌效果不一致，对个别病原菌有良好的抑菌效果。

2.2 药物MIC测定结果

由表2和表3可知，50味中药对6种猪场常见病原菌的MIC与其药敏试验结果基本吻合。以乌梅、大黄、桂枝、金银花、连翘、野菊花和五倍子等7味中药对6种猪场常见病原菌的MIC较低，故选取这7味中药进行联合用药试验。其中，乌梅对6种猪场常见病原菌的MIC分别为31.25、3.90625、7.8125、15.625、3.90625和7.8125 mg/mL，大黄对6种猪场常见病原菌的MIC分别为62.5、31.25、7.8125、62.5、7.8125和15.625 mg/mL，桂枝对6种猪场常见病原菌的MIC分别为62.5、31.25、31.25、62.5、15.625和15.625 mg/mL，金银花对6种猪场常见病原菌的MIC分别为15.625、7.8125、31.25、15.625、15.625和31.25 mg/mL，连翘对6种猪场常见病原菌的MIC分别为62.5、15.625、31.25、31.25、62.5和7.8125 mg/mL，野菊花对6种猪场常见病原菌的MIC分别为62.5、7.8125、62.5、15.625、62.5和62.5 mg/mL。

2.3 7味中药提取物的联合抑菌活性

7味中药两两联合的抑菌活性结果见表4，并根据FICI评价其联合效应。从表4可看出，乌梅+桂枝、大黄+桂枝、桂枝+连翘、桂枝+野菊花、桂枝+五倍子的FICI>2.00，表现为拮抗效应；乌梅+五倍子、大黄+连翘、大黄+野菊花、大黄+五倍子、金银花+连翘、金银花+野菊花、连翘+野菊花的FICI≤0.50，表现为协同效应；乌梅+大黄、乌梅+金银花、乌梅+连翘、乌梅+野菊花、大黄+金银花、桂枝+金银花、金银花+五倍子、连翘+五倍子、野菊花+五倍子的FICI均在0.75～1.00范围内，即0.50

3 讨论

中药是我国特有的天然资源，且具有资源广、毒副作用低等特点，在治疗感染、逆转(或抑制)细菌耐药性等方面显示出独特的优势[2,7-8]，因此寻找既有良好耐药消除效果又无毒副作用的中药，对促进畜牧业健康持续发展具有重要意义。本研究的药敏试验结果表明：乌梅、大黄、黄芩、金银花、连翘、野菊花和五倍子等7味中药对大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和放线杆菌等6种猪场常见病原菌均表现为高度敏感；而药物MIC测定结果显示，以乌梅、大黄、桂枝、金银花、连翘、野菊花和五倍子等7味中药对6种猪场常见病原菌的MIC较低。综上所述，乌梅、大黄、金银花、连翘、野菊花和五倍子等中药对猪场常见病原菌具有很好的抑菌效果，说明这些中药具有广谱杀菌作用，可能与其富含皂甙、黄酮类、有机酸等多种较强的抗菌成分有直接关系[9]。

表2 50味中药对6种猪场常见病原菌的药敏试验结果 mm

注：/表示未见抑菌圈。

与单方药物相比，复方制剂具有改善服用药品依从性、提高药物疗效、减少不良反应、降低用药费用等优点。我国中医临床学上素有使用中药复方制剂的习惯，中药复方制剂含有多种有效成分，能直接杀灭或抑制病原和增强机体免疫力，具有毒性低、多靶点、不易产生副作用和耐药性等优点，在抗菌抗病毒的同时还能促进动物生长[10]，目前在畜禽养殖业上已得到广泛应用。本研究以大肠杆菌为供试菌株，以乌梅、大黄、桂枝、金银花、连翘、野菊花和五倍子为试验用药，两两配伍后进行抑菌活性试验，并根据FICI评价其联合效应。结果表明：乌梅+五倍子、大黄+连翘、大黄+野菊花、大黄+五倍子、金银花+连翘、金银花+野菊花、连翘+野菊花呈协同效应；乌梅+大黄、乌梅+金银花、乌梅+连翘、乌梅+野菊花、大黄+金银花、桂枝+金银花、金银花+五倍子、连翘+五倍子、野菊花+五倍子呈相加效应；而乌梅+桂枝、大黄+桂枝、桂枝+连翘、桂枝+野菊花、桂枝+五倍子呈拮抗效应。其中，桂枝除了与金银花联用呈相加效应外，与其他中药联用均表现出拮抗效应。究其原因可能是桂枝中的某些主要有效成分限制或阻碍了其他中药有效成分发挥抑菌作用，但具体机理有待进一步研究证实。

表4 6味中药两两联合对大肠杆菌的抑菌活性结果 mg/mL