苯磺隆对甘蓝型油菜的杀雄效果及对其靶标ALS活性的影响

付三雄,周晓婴,戚存扣

(江苏省农业科学院/农业部 棉花油菜重点实验室,江苏 南京 210014)

目前我国油菜育种的主攻目标为选育优质杂交种,即把优质育种和杂种优势育种结合起来。实践表明,油菜具有明显的杂种优势。目前,利用油菜杂种优势的主要途径有细胞质雄性不育(CMS)、细胞核雄性不育(NMS)、自交不亲和(SI)及化学杂交剂(CHA, chemical hybridizing agent)等[1]。利用化学杂交剂生产杂交种具有许多优点,例如：(1)亲本选择范围广。化学杀雄杂种油菜是通过CHA诱导的生理性雄性不育系,不存在像细胞核质互作雄性不育体系中所要求的恢保关系,因此亲本选择自由,可任意组配杂交组合,有利于优中选优,筛选出较强的优势组合；(2)选育周期短。利用CHA可允许直接使用那些已改良产量、抗病性和品性的育种品种作杂交亲本,不需要较长的时间来进行三系的研制、转育、测试和培育,可在短时间内生产出足够数量的F1代种子；(3)避免了不育系微粉问题；(4)可利用F2代的优势。化学杀雄杂交种不存在育性恢复问题,杂交的后代又无育性分离,有实现杂种优势多代利用的可能性；(5)可有效代替人工去雄,大大减轻育种工作量[2]。因此,化学杂交剂育种将成为油菜杂种优势利用的一条重要途径。

研究和实践表明,苯磺隆是可用于油菜育种的高效无毒的化学杀雄药物[3-4]。磺酰脲类超高效除草剂的作用靶标是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)[5]。由于在人或动物体内并未发现ALS,因此这种除草剂对人和动物十分安全。乙酰乳酸合成酶(ALS, EC4.1.3.18或acetohydroxy acid synthase, AHAS),是植物和微生物体内合成支链氨基酸(branched-chain amino acid, BCAA,亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)途径的首要限速酶[6-7],是由核基因编码、定位于高等植物叶绿体中的一种蛋白。由于它是多种除草剂和生长抑制物质的作用靶标,只存在于植物和微生物中,因此ALS抑制型农药对人畜比较安全。近几十年来,国内外学者对油菜化学杂交剂育种进行了广泛的研究。湖南农业大学、西南大学、四川大学、陕西省杂交油菜研究中心等单位利用化学杂交剂制种技术已经育成推广了“湘杂油”、“渝黄”、“秦优”、“宁杂”等系列的20多个油菜杂交种,产生了明显的社会、经济效益[8～11]。油菜化学杀雄剂研究尤其是其使用虽然取得了长足的进步,但其相关基础研究仍然很薄弱,目前的研究主要集中在杀雄剂的研制及培育品种方面,而在应用基础方面的研究较少；油菜化学杀雄剂施用后对其靶标酶ALS活性的影响仅有零星研究[12],还需要进一步研究。本研究选用两个化学杀雄国审品种的母本,综合前人的研究结果,使用0.2 μg/mL苯磺隆杀雄剂在油菜小孢子发育单核期进行叶面喷施,分析了苯磺隆对油菜花器形态、农艺性状、油菜相对结实率的影响以及对ALS活性的影响,以期为在早期快速鉴定喷药效果及深入研究甘蓝型油菜化学杀雄的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甘蓝型油菜品种(系)宁油18号(化学杀雄国审品种宁杂1818的母本)和096030(化学杀雄国审品种宁杂1838的母本)来自江苏省农业科学院经济作物研究所,经多代自交纯合。供试药物苯磺隆为江苏省激素研究所股份有限公司生产的10%苯磺隆可湿性粉剂。

1.2 方法

1.2.1 田间试验 试验于2016～2017年在江苏省农业科学院溧水植物科学基地进行。在2016年10月8日播种,试验设置3个生物学重复,4行区,行长3.3 m,行距0.4 m,每行定苗20棵。田间管理同一般大田。

1.2.2 苯磺隆处理 叶面喷施苯磺隆浓度为0.2 μg/mL(有效成分的浓度)。喷药时期试验以70%油菜植株主花序最大花蕾长度为标志,喷施处理于油菜最大花蕾长度为1～2 mm时进行,用小型手动喷雾器均匀喷施药物于叶面,用塑料布把两边相邻的小区遮盖。叶面喷施第一次处理于2017年2月26日中午进行,单株用药量为8～10 mL；第二次处理相隔10 d(2017年3月9日)进行,单株用药量为8～10 mL。对照采用相同用量的水喷施。

1.2.3 观察和统计方法 在油菜初花期,喷施苯磺隆处理的3个重复从第2行的第2株开始连续选取10株挂牌,整株套袋自交用于后续考种；对照采用相同方法每重复选取10株挂牌，用于后续考种。在油菜盛花期,于上午10:00在每重复选取的10株主花序最上部摘取3朵当天开放的花朵,统计雌蕊长度、雄蕊长度、花瓣长、宽。在收获前考察每重复选取的10株的株高、一次分枝数、主花序长、角果数、每角粒数、角果长度，计算相对结实率(处理的单株总粒数/对照的单株总粒数)。

1.2.4 ALS活性的测定 于第一次苯磺隆处理后3 d，取油菜2 mm左右的花蕾于液氮中速冻,保存于-80 ℃的冰箱中，用于ALS活性的测定。参照Singh等[13]的方法测定ALS活性。以丙酮酸钠为底物,在波长530 nm处测定酶促反应产物乙酰乳酸转化产物3-羟基-2-丁酮(acetoin)的量,计算ALS活性。以单位时间(h)内单位质量蛋白(mg)生成产物3-羟基-2-丁酮的含量定义为酶活力,单位为μmol/(mg·h)。

1.2.5 数据处理 利用Excel和SPSS统计软件进行数据整理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 苯磺隆处理诱导油菜雄性不育的效果

与对照相比,经0.2 μg/mL苯磺隆处理后，油菜花瓣变小,雌蕊长度与对照无明显差异,雄蕊长度显著短于对照的,且花药干瘪(图1、表1)。

叶面喷施0.2 μg/mL的苯磺隆对宁油18号和096030油菜主要农艺性状的影响见表2。从表2可以看出：0.2 μg/mL苯磺隆处理对油菜株高、角果长度、每角粒数有显著的抑制作用,但对一次分枝数无显著影响，对主花序长有一定的促进作用。用0.2 μg/mL的苯磺隆进行叶面喷施处理后宁油18号和096030的相对结实率分别仅有3.97%和4.03%。综上所述,叶面喷施0.2 μg/mL苯磺隆可诱导油菜雄性不育，处理2次可诱导100%的全不育株率,使整个花期不育,相对结实率仅约4%。因此,叶面喷施0.2 μg/mL苯磺隆2次可以满足油菜大田制种纯度的需要。

注:“**”表示与对照在0.01水平上差异显著。下同。

2.2 苯磺隆处理下油菜ALS活性的变化

从表3可以看出,经0.2 μg/mL苯磺隆处理后,2种油菜中的ALS活性均较对照显著降低，其中宁油18号和096030经处理后的ALS相对酶活分别为40.63%和37.23%。

3 讨论与结论

合适的苯磺隆浓度是影响油菜化学杀雄效果的重要因素,浓度小,杀雄不彻底;浓度过大,易出现药害,影响结实率,导致制种产量低。虽然浓度与剂量也可以高低搭配使用,但与剂量相比,浓度是更重要的因素,如果浓度较低,剂量较大,不能达到理想的杀雄效果;反之,在一定剂量下,高浓度比低浓度杀雄效果好,导致药害的可能性也加大。前人研究发现磺酰脲类用于杀雄的最低浓度为0.02 μg/mL,最高浓度为20 μg/mL。张宝娟等[3]的研究结果表明,苯磺隆叶面喷施处理浓度范围为0.075～0.1 μg/mL,单株用药量为15～20 mL时,杀雄彻底,药害较轻。黄驰等[4]的研究结果表明：在成都地区油菜重要骨干自交系主花序最大花蕾长度达1.50～2.00 mm时用苯磺隆进行第一次叶面喷施,隔10 d左右再进行第二次喷施,每次单株受药量8～10 mL,0.30 μg/mL苯磺隆可诱导群体90%以上的不育株率;每次单株受药量15～20 mL,0.05～0.10 μg/mL苯磺隆可诱导群体100%的不育株率,且无药害,能保持整个花期不育。综合前人的研究结果,我们通过叶面喷施0.2 μg/mL苯磺隆,单株用药量8～10 mL,间隔10 d左右再进行第2次处理,单株用药量8～10 mL,叶面喷施2次可诱导100%的全不育株率,使整个花期不育,相对结实率仅约4%,表明0.2 μg/mL苯磺隆处理2次可以满足油菜大田制种纯度的需要。

表2 叶面喷施苯磺隆对油菜主要农艺性状的影响

表3 叶面喷施苯磺隆对油菜中ALS活性的影响

阻碍油菜化学杀雄剂推广应用的一个难点是化学杀雄剂使用后的效果评价。以往研究仅仅侧重于从花瓣的大小及直径、柱头长短、结实率、植株育性及植株高度等性状评价化学杀雄剂的效果,但是要获取这些评价指标基本在药效发挥的中后期及结实期,对于化学杀雄剂喷药量及喷药效果的预测无能为力,若发生药害或喷药量不足,想再实施补救措施则为时已晚。因此如何在早期快速鉴定喷药效果成了当前亟待解决的问题。近年来有不少通过测定ALS的活性来研究植株对除草剂抗性的快速鉴定方法[14-15]；李亚东等[16]的研究结果表明,新疆不同小麦品种之间ALS活性差异极为显著。刘伟等[17]研究得出不同作物间甚至同种作物不同品种间对ALS抑制剂类除草剂的耐药性均存在差异,不同品种小麦对啶磺草胺的耐受性同样存在极显著差异。最近的研究从分子水平上验证了ALS基因的表达量变化及突变可以影响植物对除草剂的抗性[18～20],说明这也可能是一个有效的方法。我们在前期研究中发现：ALS基因存在组织表达特异性,在叶片中表达量最大,在4轮花器官(萼片、花瓣、心皮和雄蕊)均有表达,说明ALS参与植株发育,参与花器官的发育；在花瓣和雄蕊中表达最弱,表明雄蕊不易受影响。本研究尝试在喷药早期活体测定ALS的活性,通过比较对照与处理之间的差异来快速鉴定和预测杀雄剂苯磺隆的喷药量是否达到合理范围,结果表明在苯磺隆处理下2种油菜中的ALS活性均比对照显著降低,ALS相对酶活分别为40.63%和37.23%,说明ALS活性的变化有可能作为快速鉴定和预测杀雄剂的喷药量是否达到合理范围的指标。但是前人的离体试验研究表明：不同玉米品种对单嘧磺隆的敏感性有差异,单嘧磺隆对不同玉米品种ALS活性的影响存在差异,但对同一自交系玉米的ALS活性的影响差异不大；低浓度的单嘧磺隆可刺激活体ALS的活性,高浓度的则具有抑制作用[21]。因此要建立不同品种的ALS活性与不同药剂喷药剂量之间的函数关系需要植物品种特性、植株大小、ALS活性、药剂吸收量等多年份的统计数据，这样才能预测得到更为精准的杀雄剂合理施用剂量。