紫穗槐花总黄酮提取工艺的优化
2019-03-07黎代余刘洪明汪青筑陈志怡彭永贤
黎代余， 刘洪明， 汪青筑， 陈志怡， 彭永贤
(毕节职业技术学院，贵州 毕节 551700)
紫穗槐花为豆科植物紫穗槐(AmorphafruticosaL. )的干燥花蕾，具有清热解毒、凉血止血的作用。紫穗槐在我国大部分地区均有分布，其花期与槐花花期基本一致，由于花的形态与槐花相似，当地民众常采集食用。范珊珊等[1-2]研究结果表明，紫穗槐的化学成分以黄酮为主，此外还含二苯乙烯苷、挥发油、甘油酯及多糖等成分。姜泓等[3-4]研究发现，穗槐根提取物具有一定的抗肿瘤、抗病毒、保肝及杀虫等作用。赵昱玮等[5-6]分别对紫穗槐根和叶中总黄酮进行了提取和纯化研究。目前，对紫穗槐花的研究主要集中在挥发性成分方面[7-8]，对其花中黄酮的研究未见报道。鉴于此，采用单因素试验与响应面分析法相结合研究紫穗槐花总黄酮的最佳提取工艺，以期为紫穗槐花的开发利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 紫穗槐花 采自贵州省毕节市双山镇归化村，经贵州工程应用技术学院生态学院鉴定为豆科植物紫穗槐(Amorphafruticosa)的干花蕾。
1.1.2 试剂 芦丁对照品，中国食品药品鉴定研究院；AlCl3、NaAc、HAc、乙醇、甲醇，均为分析纯，市购。
1.1.3 仪器设备 Evolution 600型紫外分光光度计，美国ThermoFisher公司；十万分之一电子分析天平；超声机。
1.2 试验方法
1.2.1 材料预处理
1) 芦丁对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品约10.88 mg置25 mL容量瓶中，加入甲醇适量，超声使其溶解，放冷，再加入甲醇至刻度，摇匀即得0.435 2 mg/mL的芦丁对照品溶液。
2) 紫穗槐花粉末制备。将紫穗槐花净制后于105 ℃杀青后在60℃条件下干燥。取1.0 kg经乙醚处理，挥去乙醚并干燥，粉碎后过40目筛备用。
1.2.2 最大吸收波长扫描 参照文献[9]的方法，精密吸取芦丁对照品溶液0 mL和4.0 mL分别置于25 mL容量瓶中，依次加入1 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液，1 mL pH 5.2的NaAc-HAc溶液，及适量乙醇至刻度，摇匀后静置10 min，然后取5.0 mL在波长300～500 nm处用紫外分光光度计进行扫描，得芦丁的最大吸收波长。
1.2.3 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液 0 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL及3.0 mL分别置于50 mL容量瓶中，按照1.2.2的操作在最大吸收波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液的浓度(x)为横坐标，吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.4 不同因素对紫穗槐花总黄酮提取的影响
1) 乙醇浓度。试验设6个处理，即分别加入20%、30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液。精密称取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞锥形瓶中，按料液比1∶30分别加入不同浓度的乙醇溶液，45kHz 200W超声提取3次，每次40 min，然后将提取液过滤、合并、浓缩后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供试品溶液。取1 mL供试品溶液于10 mL容量瓶中，按照1.2.2的操作在最大吸收波长下测定吸光度，计算总黄酮的提取率。
2) 料液比。试验设7个处理，即料液比(g∶mL)分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 及1∶45。精密称取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞锥形瓶中，按不同料液比分别加入浓度80%的乙醇溶液，45 kHz 200 W超声提取3次，每次40 min，然后将提取液过滤、合并、浓缩后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供试品溶液。供试品溶液吸光度测定及总黄酮提取率计算同上。
3) 提取次数。试验设4个处理，即提取次数分别为1次、2次、3次和4次，精密称取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞锥形瓶中，按料液比1∶40加入浓度80%的乙醇溶液80 mL，45 kHz 200 W超声提取1～4次，每次40 min，然后将提取液过滤、合并、浓缩后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供试品溶液。供试品溶液吸光度测定及总黄酮提取率计算同上。
4) 提取时间。试验设6个处理，即提取时间分别为25 min、30 min、35 min、40 min、45 min及60 min。精密称取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞锥形瓶中，按料液比1∶40分别加入浓度80%的乙醇溶液，45 kHz 200W超声提取3次，然后将提取液过滤、合并、浓缩后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供试品溶液。供试品溶液吸光度测定及总黄酮提取率计算同上。
1.2.5 最佳提取工艺条件优化 综合单因素试验结果，选取对总黄酮提取得率影响较大的因素，根据BBK中心组合试验设计原理，利用Design-Expert V8.0进行响应面分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
通过测定得芦丁的最大吸收波长为403 nm。以吸光度为纵坐标(y)，以芦丁质量浓度为横坐标(x)绘制得芦丁标准曲线(图1)。根据不同浓度芦丁标准品溶液的吸光度，拟合得到线性回归方程为y=24.744x-0.000 8，R2=0.999 1。说明，相关性较好。
图1 芦丁标准曲线
Fig.1 The standard curve of rutin
2.2 不同因素处理紫穗槐花总黄酮的得率
从图2可见，乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对紫穗槐花总黄酮提取率的影响程度不同。
2.2.1 乙醇浓度 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响较大，随乙醇浓度的增加总黄酮得率呈先增大后减小趋势。当乙醇浓度为80%时达最大，为2.49%；浓度继续增大总黄酮得率反面减小。因此，适宜乙醇浓度为80%。
图2 不同因素处理紫穗槐花总黄酮的得率
2.2.2 料液比 随料液比增加总黄酮得率呈波动增加趋势。当料液比(g∶mL)为1∶40时总黄酮得率最高，为2.52%；继续增加溶剂总黄酮得率反而减少。因此，适宜料液比为1∶40。
2.2.3 提取时间 提取时间对总黄酮得率的影响较小，在超声提取40 min时，总黄酮得率相对最高，为2.26%。因此，适宜提取时间为40 min。考虑时间和成本的因素，试验将以超声提取40 min为紫穗槐花总黄酮提取的适宜时间。
2.2.4 提取次数 提取次数是影响总黄酮的重要因素，随提取次数增加总黄酮得率呈先增大后减小趋势。当提取次数为3次时，紫穗槐花总黄酮得率最高，为2.51%；次数继续增加提取的总黄酮含量没有明显的变化。因此，试验适宜提取次数为3次。
2.3 紫穗槐花总黄酮提取工艺的优化
根据单因素试验结果，由于提取时间对得率影响较小，因此Box-Behnken设计以总黄酮的得率为响应值(Y)，仅选择对总黄酮超声提取影响较大的因素乙醇浓度(A)、料液比(B)和提取次数(C)进行优化试验(表1)。从表2看出，处理16的总黄酮得率最高，为2.67%；其次是处理3和处理7，均为2.63%；处理10最低，为2.00%。对影响因素进行回归拟合得到回归方程：Y=2.62-0.069A+0.045B+0.12C-0.053AB-0.015AC+0.058BC-0.16A2-0.17B2-0.23C2，R2=0.964，表明，实测值与预测值相符度高，误差小。失拟项P=0.128 0，表明该模型失拟不显著。同时，该回归模型F=20.63，P<0.001，为极度显著。表明，模型充分拟合试验数据，响应值总黄酮得率与所选变量乙醇浓度(A)和提取次数(C)高度相关各种因素间存在一定的交互作用，其中，B2、C2为极度显著项(P<0.001)，C、A2为显著项。3个因素的FA、FB和FC分别为10.22、4.38和29.23，其对总黄酮提取的影响依次为C>A>B。
表1紫穗槐花总黄酮提取工艺的响应面试验设计因素与水平
Table 1 The factor and level of response surface experimental design for total flavonoids extraction technology fromA.fruticosaflowers
从图3可更直观的看出各因素间的相互作用对响应值的影响。其中，料液比和提取次数的交互作用最明显，对总黄酮得率的影响最为显著，表现为曲线较陡，即随着料液比和提取次数的变化总黄酮得率显著变化；乙醇浓度和料液比对总黄酮得率的影响较小，表现为曲线较平缓，即随着料液比和提取次数的变化总黄酮得率变化较小。由此确定紫穗槐花总黄酮提取工艺条件为乙醇浓度86.99%、料液比为40.67∶1、提取次数为2.24次。在此条件下，紫穗槐花总黄酮的得率为2.503 4%。综合考虑时间和成本等因素的情况下对工艺进行修正，确定最终工艺条件为85%乙醇、料液比为40∶1、提取2次，每次提取时间40 min。此工艺条件下3次平行试验的结果表明，紫穗槐花总黄酮的得率为2.516 1%，与理论值的偏差为1.14%。表明，采用响应面优化的紫穗槐花总黄酮提取工艺条件可靠。
表2紫穗槐花总黄酮提取工艺的响应面试验方案与结果
Table 2 The scheme and results of response surface experiment for total flavonoids extraction technology fromA.fruticosaflowers
图3 2因素交互作用紫穗槐花总黄酮得率的响应图及等值线
Fig.3 Response charts and isograms of two factors’ interaction to total flavonoids yield extracted fromA.fruticosaflowers
3 结论与讨论
试验结合生产实际，同时考虑总黄酮含酚羟基较多、极性较大，所以以乙醇为提取溶剂。在使用Design- Expert软件进行试验优化时，在单因素试验基础上，选取对总黄酮提取影响较大的因素乙醇浓度、料液比和提取次数3个因素进行优化，通过回归方程和软件分析，得出紫穗槐花提取的最佳工艺为85%乙醇、料液比为1∶40(g∶mL)、提取2次，每次提取时间40 min。此工艺条件稳定可靠。
在考察料液比对总黄酮得率的试验中，当料液比超过1∶40(g∶mL)后总黄酮得率不断降低，可能的原因是由于溶剂的增加增大了其他物质的溶出，从而影响了黄酮类成分的溶出。该试验未采用《中国药典》中亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠为显色剂，是因为在此显色条件下，样品和对照品没有最大吸收波长。以三氯化铝为显色剂，不但在403 nm处有最大吸收波长，而且显色条件稳定可靠，可能的原因尚需进一步研究。
