南昌市周边主要水产养殖区池塘养殖草鱼体内优势细菌调查

徐先栋，付辉云，陈文静，章海鑫，饶 毅，周智勇

(江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039)

随着生活水平的提高，消费者对水产品的需求由数量型转为质量型，对优质水产品的需求越来越迫切[1-2]。水产品品质受到养殖水质、投喂策略、流通加工等环节影响，现有文献对上述几种因素与水产品品质的关系多有阐述[3-5]，池塘养殖水产品体内含有的优势菌群也是影响水产品品质的一大因素[6]，目前相关报道较少。江西省南昌市地处长江中下游、鄱阳湖畔、赣江之滨，为鱼米之乡，是我国主要的淡水水产品生产地区。本文对江西省南昌市周边地区的池塘养殖草鱼体内细菌进行调查，探索养殖草鱼体内优势菌群的种类，对所分离的细菌进行遗传背景分析，并挑选不同地区的分离菌进行药敏实验，以分析该地区草鱼体内优势菌群分布情况及耐药性，为渔业生产以及水产品品质评估提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

TSA和TSB培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、DL2000 marker、dNTPs和 Ex Taq酶均购自大连宝生物公司。

1.2 细菌分离

细菌样品采集自江西省南昌市周边主要水产养殖区，包括蒋巷镇、罗家集镇、塘南镇、南新乡等乡镇的草鱼养殖池塘(图1)，采样时间为2016年6～10月。在每个采样地点分别随机取3尾草鱼，用灭菌纯净水清洗体表，然后使用75%酒精棉球擦拭体表，在酒精灯焰旁解剖草鱼，用TSA平板从鱼体肝脏部位分离细菌，采用划线分离培养的方法进行培养，于30 ℃培养24 h后记录结果。挑取形态一致的优势菌以TSA培养基纯化培养，直至获得纯培养菌。同时将优势菌株培养液与等体积50%甘油混合，于-80 ℃冰箱中长期保存备用。

图1 采样点示意图(黑点标示为采样地点)

1.3 16S rDNA序列测定与分析

纯化后的分离菌经振荡培养24 h后，使用试剂盒提取细菌总DNA，对病原菌的16S rDNA序列进行PCR扩增与测序。PCR引物为：正向引物27F 5′- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，反向引物1492R 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3′，扩增目的片段大小约为1.5 kb。

PCR反应体系(50 μL)：ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)5 μL，正向引物27F(10 μmol/L)1 μL,反向引物1492R(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，加超纯水至总体积50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s，30个循环；最后于72 ℃温育10 min。1%琼脂糖电泳观察结果。PCR产物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司进行核苷酸序列测定。所测序列通过Genbank同源性比对，鉴定分离菌株。

1.4 ERIC-PCR分型

肠杆菌基因间重复共有序列(Enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)-PCR特异性引物序列为：正向引物(F):5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′；反向引物(R):5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。ERIC-PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)2 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，TaKaRa ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，以灭菌ddH2O补足至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性7 min；90 ℃变性30 s、52 ℃退火1 min、65 ℃延伸8 min，35个循环；最后于68 ℃温育16 min。PCR扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压80 V，时间2 h，拍照观察。

1.5 药敏实验

根据细菌鉴定结果，随机选取不同地方分离的代表菌株，使用药敏纸片扩散法对选取的菌株进行药敏检测[7]。方法如下，菌株经Muller-Hinton肉汤培养基过夜培养，使用麦氏比浊管调整细菌浓度为108CFU/mL。取100 μL菌液，涂布Muller-Hinton琼脂平板，使用无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，轻压一下纸片，每个平板均匀贴布6片纸片。30 ℃培养24 h，记录抑菌圈直径。参照CLSI药敏纸片解释标准[7]，判断菌株对药物的敏感性，结果记为敏感(susceptible，S)，中度敏感(intermediary，I)和抗药(resistant，R)。共选择了8类12种药敏纸片用于实验(表1)。

1.6 数据统计

数据统计使用Excel 2007软件进行。

表1 药敏实验所用药敏纸片种类

2 结果

2.1 草鱼体内细菌分离结果

本次对南昌市周边地区池塘养殖草鱼体内细菌进行分离纯化，共得到56株优势菌株，对优势菌株的16S rDNA基因进行了扩增和测序，得到全部菌株的16S rDNA片段，Genbank登录号为KY767483～KY767538(表2)。56株菌株16S rDNA基因序列在Genbank中的同源性比对结果显示，81%的菌株为不动杆菌属细菌，其中34株细菌鉴定为抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)，占总菌株数的61%，8株细菌鉴定为约氏不动杆菌(Ac.johnsonii)，占总数的14%，其他不动杆菌属细菌包括琼氏不动杆菌(Ac.junii)、鲍曼不动杆菌(Ac.baumannii)及皮特不动杆菌(Ac.pittii)各1株，占总数的6%。有7株菌株16S rDNA序列与维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)标准菌株(ATCC35624)比较，相似率大于97%，初步鉴定为维氏气单胞菌[8]，占总菌株数的12%，另外戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)2株，芽孢杆菌属细菌(Bacillus)及葡萄球菌属细菌(Staphylococcus)各1株。

表2 草鱼体内分离细菌信息表

注：BL北沥，CC滁槎，GH国鸿，JX蒋巷，LJ罗家集，NX南新，TN塘南，WA五爱，YH瑶湖。

2.2 ERIC-PCR分型结果

分离的34株抗辐射不动杆菌ERIC分型结果(图2)表明，ERIC-PCR条带相似，都能扩增出约9条条带，含有一条大小约为1600 bp明显条带。约氏不动杆菌ERIC分型结果表明有4株菌条带相似，其他3株菌条带存在差异(图3)，琼氏不动杆菌、鲍曼不动杆菌及皮特不动杆菌均扩增出约10条条带(图3)。7株维氏气单胞菌ERIC分型结果表明，各菌扩增条带均不一样，条带数在3～10条不等，多态性明显(图4)。

1-WA16091, 2-WA16092, 3-WA16094, 4-JX16091, 5-JX16094, 6-JX16097, 7-JX16090, 8-JX16095, 9-YH16104, 10-CC16102, 11-LJ16108, 12-LJ16107, 13-LJ16106, 14-LJ16105, 15-LJ16104, 16-LJ16103,17- TN16102,18-TN16101, 19-NX16101, 20-NX16102, 21-NX16103, 22-JX16096, 23-TN16103, 24-TN16104, 25-GH16093, 26-GH16092, 27-LJ16091, 28-GH16091, 29-JX16913, 30-WA16095, 31-JX16914, 32-JX16911, 33-JX16916, 34-JX19915.

图234株抗辐射不动杆菌ERIC-PCR指纹图谱

Lnae M：DL2000 Marker；1-JX16093, 2-JX16099, 3-YH16105, 4-CC16101, 5-BL16102, 6-YH16101, 7-CC16103(Ac.Johnsonii); 8-JX16092(Ac.junii), 9-YH16102(Ac.pittii), 10-WA16096(Ac.baumannii)

图3其他不动杆菌ERIC-PCR指纹图谱

2.3 药敏实验结果

选取的17株菌药敏结果见表3和图5。不动杆菌属细菌对庆大霉素、丁胺卡那霉素、恩诺沙星敏感，对青霉素耐药。大部分不动杆菌属细菌对对头孢曲松、四环素和复方新诺明敏感，对氨苄西林、氯霉素、氟苯尼考、多粘菌素b耐药。所有的维氏气单胞菌对庆大霉素、丁胺卡那霉素、恩诺沙星、头孢曲松、复方新诺明、多粘菌素b、氟苯尼考敏感，对青霉素耐药，绝大部分的维氏气单胞菌对四环素、氯霉素类药物敏感，对氨苄西林耐药。不动杆菌细菌耐药性最高的菌株为NX16101，对6种药物表现耐药性，最低的为JX16091，只对青霉素和麦迪霉素两种药物耐药，其余菌株耐药种类为3～5种不等。维氏气单胞菌菌株只对2～3种药物耐药。

M：DL2000 Marker；1-BL16104, 2-JX16104, 3-BL16103, 4-BL16105, 5-JX16102, 6-YH16103, 7-JX161021

图4维氏气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱

3 讨论

随着我国水产养殖业的发展，养殖鱼数量占据比重大大超过捕捞鱼类数量，如2016年全国水产品总产量6699.65万t，其中，养殖产量4937.90万t，占总产品的73.7%[9]，渔业生产的主要矛盾也已由原来的渔获物数量需要同产能不足之间的矛盾，转变为日益增长的优质水产品需要同优质水产品数量不足之间的矛盾，养殖水产品质量问题日益引起消费者的重视。水产品质量受养殖、流通和加工等环节中的多种因素影响，其中养殖环节中水产品体内所含菌群种类对水产品质量影响很大[6]。有些菌群是新鲜鱼类正常寄生菌群，对鱼肉品质影响不大，有学者对新鲜养殖鱼体内主要菌群进行了研究，表明不动杆菌属细菌为新鲜鱼体内优势菌。如王航[6]从新鲜草鱼肉中共分离出58株菌，结果表明新鲜鱼肉中的微生物主要为革兰氏阴性菌，不动杆菌属细菌是新鲜草鱼片的化势菌，占总菌数的33%。Parlapani等[10]研究了养殖海鲈的初始微生物构成，也发现不动杆菌属(Acinetobacter)是其优势菌属。有些菌群对鱼品质造成很大影响，常常使鱼肉腐败发臭，为腐败菌，主要包括气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella)细菌。腐败草鱼中的优势菌群主要为上述几种腐败菌[6]。本文从南昌周边养殖池塘草鱼体内分离的优势菌株，79%为不动杆菌属细菌，较少见腐败菌及致病菌，表明在草鱼养殖阶段品质较好，可能与南昌周边地区位于赣江之滨、鄱阳湖畔，拥有丰富的水资源以及优质的水质环境有关。不过，值得注意的是本研究从鱼体分离的腐败菌气单胞菌属细菌的16S rDNA序列与维氏气单胞菌标准菌株相似度最高，大于97%，很大可能均为维氏气单胞菌，该菌为一种条件致病菌，在水质恶化、水产动物免疫力低等情况下，感染水产动物致动物患病[11-12]。近年来，维氏气单胞菌病呈现多发趋势，已成为我国淡水养殖动物最重要的细菌性病原之一[13-14]，需要引起重视。

表3 草鱼体内分离菌对12种抗生素的药敏结果

注：S敏感，I中度敏感，R耐药；判定标准：小于中间数值为抗药，中间数值为中度敏感，大于中间数值为敏感；数字为抑菌圈直径，单位mm；*为维氏气单胞菌，#为约氏不动杆菌，其他为抗辐射不动杆菌细菌。

ERIC-PCR是一种常用的细菌分子分型手段，具有不要求模板序列已知而能直接进行PCR扩增的优点，同时，由于其引物序列较长，PCR反应退火温度较高，因此能得到稳定性好、重复性高、多态性丰富的电泳图谱，可用来区分同一种类细菌的不同株(型)[15]。在不动杆菌属细菌分型研究中，有学者应用ERIC-PCR技术对鲍曼不动杆菌(Ac.baumannii)进行过分型研究，通过分型可以对细菌的来源及遗传特性分类，主要的条带位置和数量相同可视为同一个基因型[16]。对抗辐射不动杆菌的分型尚未见报道，本文研究的抗辐射不动杆菌均为同一个ERIC型，表明本研究所分离的抗辐射不动杆菌可能来源于同一个遗传型。ERIC-PCR技术对维氏气单胞菌分型研究多有报道[17-19]，该方法是一种针对维氏气单胞菌分型研究成熟的方法。本文中6株维氏气单胞菌的ERIC-PCR条带均不一样，表明该地区的维氏菌多态性比较丰富，不过因本研究所采用的维氏气单胞菌株数量较少，不完全代表该地区的维氏气单胞菌遗传性特征。该地区的维氏气单胞菌更详细的分型以及主要遗传性菌株研究有待进一步发掘。

图5 不动杆菌属细菌(A)和维氏气单胞菌(B)对不同抗生素耐药菌株数分析

抗辐射不动杆菌的药敏研究较少见报道，同属的鲍曼不动杆菌因其对人类健康的重要影响——是我国目前最重要的“超级细菌”[20]，药敏研究报道较多[21-22]。本文分离的抗辐射不动杆菌仅表现出对青霉素、麦迪霉素全部抗药，对多粘菌素b绝大部分抗药，对其他药物药敏或多或少地表现出敏感或全部敏感，为低耐药性菌株。不过，值得注意的是不同于临床分离的鲍曼不动杆菌，普遍具有较强的耐药性而对“非常规抗生素”多粘菌素均较敏感[21,23]，本文分离的抗辐射不动杆菌对多粘菌素具有较强的耐药性。推测原因有可能是抗辐射杆菌本身不同于鲍曼不动杆菌的特性，或是南昌周边地区的抗辐射不动杆菌由于选择压力获得抗药性，确切原因有待更多的抗辐射不动杆菌药敏实验研究证实。

本文分离的维氏气单胞菌均对青霉素表现出耐药性，对青霉素类药物耐药可能是气单胞属细菌的固有耐药性[24]。对喹诺酮类、氯霉素类、第三代头孢类药物敏感，同已有报道不尽相同[25-27]，可能与维氏气单胞菌的耐药性存在地域差别，不同地区，不同来源菌株耐药性均不同有关[13]。本文分离的维氏气单胞菌耐药性较低，同作者前期研究嗜水气单胞菌结果相类似[28]，表明南昌周边地区草鱼养殖抗生素使用比较合理，菌株没有产生大规模的多重耐药性。本文选用了青霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素等几种禁用药物进行药敏实验，仅用于研究菌株的耐药性，不作为生产上病害防治用药参考。