麦鲮(Cirrhina mrigola)肌肉组织在孔雀石绿阳性环境中的残留消除规律

刘书贵，李丽春，单奇，尹怡，马丽莎，赵城，戴晓欣，郑光明

(中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产种质资源利用与养殖重点实验室，农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)，农业部休闲渔业重点实验室，广州 510380)

孔雀石绿(malachite green, MG)又名碱性绿，是一类具有较强杀菌能力的染料类药物，被广泛用于纺织业、制陶业和皮革业，也作为食品染色剂和细胞化学染色剂等[1]使用，也曾被用于预防或治疗水产动物的多种疾病，如水霉病、烂鳃病和小瓜虫病等，特别在治疗水霉病上具有显著作用[2-3]。研究发现，若MG及其代谢物无色孔雀石绿(leucomalachite green, LMG)通过食物富集到人体内，会对人体造成潜在致癌、致畸和致突变危害[4-5]。因此，多个国家水产养殖业已禁用MG，中国水产养殖也在2002 年规定禁用MG[6]。但由于MG抗菌效果好、价格便宜等因素，偶有养殖户在养殖过程中违规使用。

MG 用于水产动物病害防治时通常采用药浴全鱼或鱼卵的方式，偶有养殖户为节省成本采用全塘泼洒的方式。刘书贵等[7]将200 μg/L MG进行全塘泼洒，结果表明，2周后水体中检测不到MG和LMG。但杨秋红等[8]以全池泼洒的投药方式，研究MG(池塘中MG的理论浓度为 1 mg/L)及LMG在斑点叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)肌肉和皮肤以及养殖水体和底泥中的残留消除规律，发现MG和LMG至360 d时仍有检出(5.92±1.23)μg/kg。程杏安等[9]监测珠江三角洲10个池塘底泥中MG和LMG残留，研究结果表明10个池塘中均有MG检出。目前，MG 在水产动物体内残留消除规律的研究主要集中在杂交鳢(斑鳢Channamaculata♀×乌鳢Channaargus♂)[7]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[10]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[11]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[12]、鳗鲡(A．anguilla)[13]、鲫(Carassiusauratus)[14]、罗非鱼(Oreochromisspp．)[15-16]、斑点叉尾鮰(IetalurusPunetaus)[17]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[18]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[19-20]等品种。MG及其代谢物LMG在水产动物体内的代谢规律问题已引起高度关注。

麦鲮(Cirrhinamrigola)属于硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、鲮属(Cirrhinus)，是一种亚热带杂食性底层鱼类，具有肉质鲜嫩、养殖周期短、生长快、耐冻、病害少及可高密养等优点。自1982年从孟加拉国引入中国以来迅速得到推广，现已成为华南地区重要的淡水经济鱼类和加工附加值较高的鱼类之一[21]。又因其具与鳜(Sinipercachuatsi)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)等名贵鱼类相似的生活习性，现常被作为饵料鱼大量供应于名优鱼类的高密度养殖中。值得关注的是，目前关于MG在麦鲮肌肉组织中代谢规律的相关研究尚未见报道，另经MG阳性环境池塘养殖的麦鲮是否会造成以其为饵的名优鱼类体内MG及其代谢产物LMG的残留问题的相关研究亦未见报道。

为探明上述问题，本研究模拟自然养殖条件，将泼洒过MG 的池塘换水后放养麦鲮，研究不同放养时间下麦鲮肌肉中的MG及其代谢物LMG残留量情况，探讨MG/LMG在其体内的残留消除规律，以期丰富MG在鱼类的代谢富集研究，同时为加强MG的违规使用监管及溯源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料与养殖场所

无MG及LMG残留的麦鲮由中国水产科学研究院珠江水产研究所良种基地提供，平均体重为(2.68±0.51)g，体长为(5.50±0.50)cm，约20 000尾，养殖场所位于广东省高要市中国水产科学研究院高要良种科技园2个水泥养殖池 (池面积12 m2)。

1.1.2 试剂与药品

MG和LMG标准品，纯度 ≥ 95%(Dr.Ehrenstorfer公司)；孔雀石绿-D5(D5-MG)和无色孔雀石绿-D6(D6-LMG)标准品，纯度>99%(Witega公司)。甲酸购自日本TCI公司，乙腈和甲醇购自德国Merck公司，石墨化炭黑(GCB)购自Agela公司。乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)，冰乙酸、无水乙酸铵均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.1.3 主要仪器

包括e2695-Quattro Micro API三重四级杆液质联用仪(Waters 公司)；超声波水浴(宁波新芝公司)；DL-5M离心机(上海飞鸽公司)；IKA MS3漩涡振荡器(德国IKA公司)；IKA T18匀浆机(德国IKA公司)；旋转蒸发仪(日本Eyela公司)等。

1.2 残留消除实验

1.2.1 实验分组及给药

两个养殖池(4.0 m×3.0 m×0.8 m)分别铺10 cm无MG和LMG残留的底泥，待底泥硬化后蓄水，然后泼洒MG使之质量浓度为1 mg/L，放置7 d后换水，并分别放2 500尾麦鲮进行试验。1年后对其分别换水，使水位和初始水位保持一致，再分别放7 500尾麦鲮进行试验，用阴性饲料喂养并测定水温。

1.2.2 样品采集

初次放养麦鲮后，于0、0.5、1、2、3、5、10、15、20和30 d取麦鲮样品；次年再次放养后于0、1、2、5、10、15、20、30、40、50、70、90、120、150和180 d取麦鲮样品，每个时间点从2个水泥池中分别采集4个样品，每个样品重量以满足检测为宜。去头和内脏后取肌肉组织于-20 ℃条件下保存，待测。根据实验需要可考虑采集更长时间点的样品。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备液和标准工作液依据参考文献[22]配制。

1.3.2 样品前处理

称取5.0 g已绞碎肌肉组织样品于50 mL离心管中，加入200 μL 100 ng/mL混合内标标准溶液，加入5 g无水硫酸镁和11 mL乙腈，超声波振荡提取2 min，8 000 r/min匀浆提取30 s，4 200 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL比色管中；另取一支50 mL离心管加入11 mL乙腈，洗涤刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中；用玻璃棒捣碎离心管中沉淀，涡旋振荡30 s，超声波振荡5 min，4 200 r/min离心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25 mL，摇匀备用。

准确移取5.00 mL样液于磨口玻璃管中，45 ℃旋转蒸发至干，准确加入2.00 mL乙腈5 mmol/L乙酸铵溶液(1∶1，V/V)后转移至5 mL离心管中，加入50 mg PSA+10 mg GCB，涡旋混合1 min，12 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜后供HPLC-MS/MS测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为XTerra MS C18柱，100.0 mm×2.1 mm(i.d.)，粒度3.5 μm。流动相A为乙酸铵缓冲溶液(5 mmol/L，pH 4.5)，流动相B为乙腈，进样量10 μL，柱温35 ℃，流速0.20 mL/min，梯度洗脱条件见表1。

1.3.4 质谱条件

离子化模式为ESI+；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流速 700 L/h；电离电压3.5 kV；扫描模式为反应监测(MRM)。质谱参数如表2所示。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Conditions of gradient elution

注：流动相A为乙酸铵缓冲溶液，流动相B为乙腈。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

注：标注“*”的子离子用作定量分析。

1.3.5 标准曲线的绘制与测定

将“1.3.1”中的混合标准工作液配制成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和200.0 ng/mL，共8个质量浓度注入高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，在0.5～200.0 ng/mL范围内，以目标物与内标峰面积之比为纵坐标Y、质量浓度为横坐标X绘制标准曲线，求出线性方程和相关系数。

1.3.6 回收率及精密度的测定

在空白样品中加入5.0、10.0和100.0 μg/kg 3个含量水平MG及其LMG标准溶液，按照“1.3.2”样品处理方法进行处理，每个加标水平测定6份平行样，计算方法的回收率及相对标准偏差(RSD)以衡量方法的精密度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、检出限及定量限

在质量浓度1.0～200.0 ng/mL范围内，以目标物与内标峰面积之比为纵坐标Y、质量浓度为横坐标X绘制标准曲线，MG和LMG的标准曲线方程分别为Y=1.035 78X+0.854 70和Y=1.475 25X+0.258 50，相关系数r分别为0.999 4和0.998 2。因而在该浓度范围内MG和LMG分别呈现良好的线性关系。该方法检出限与定量限均为0.50 μg/kg。

2.2 回收率和精密度

在加标水平5.0～100.0 μg/kg范围内时，所得到的MG和LMG的回收率及相对标准偏差见表3。MG在5.0～100.0 μg/kg范围内平均回收率为92.50%～101.00%，相对标准偏差为2.36%～7.57%，而LMG在5.0～100.0 μg/kg范围内平均回收率为89.40%～94.60%，相对标准偏差为1.26%～5.21%。

表3 空白样品加标回收率和精密度Tab.3 Recoveries of spiked samples and RSDs n=6

2.3 首次放养MG和LMG在麦鲮肌肉中的残留量分析

首年6月份将麦鲮首次放养于水温(31±1.5)℃池中30 d，记录肌肉中MG和LMG在不同时间点的残留量(表4)及变化趋势(图1)。MG残留量先随时间波动式上升后逐渐下降至160.00 μg/kg左右达到动态平衡, LMG残留量同样先随时间波动式上升后逐渐下降至3 370.00 μg/kg左右并达到动态平衡。2 d时MG和LMG残留量结果变化较大，可能由于其内脏去除不完全导致。本实验中，首次样本放养量预估不足，导致采样时间只持续30 d，为此在次年放养中将每池塘的放养量由2 500尾增加至7 500尾。

表4 MG浸染池塘中养殖鲮肌肉组织中MG和LMG的残留量Tab.4 Residues of MG and LMG in Cirrhinamrigola samples from pond pretreated with MG

2.4 次年再次放养MG和LMG在麦鲮肌肉中的残留量分析

次年6月相同水温的池塘再次放养麦鲮后，记录肌肉中MG和LMG在实验过程中不同时间点的残留量(表5)及变化趋势(图2)。0～70 d 期间，MG一直维持在(1.43±2.45)～(4.98±2.01)μg/kg，直到90 d后未检出， LMG在0～5 d残留量从(3.10±2.31)μg/kg上升到(105.30±8.25)μg/kg，随后波动式下降直至180 d低于定量限(0.50 μg/kg)。这可能是因为首年水体中MG被底泥吸附，次年经换水放养麦鲮后，麦鲮将通过食底泥中有机物而富集其中的MG。杨秋红等[8]将MG在水中溶解后进行全池泼洒，在用药后在水体MG含量为1 mg/L时左右采集水样和底泥进行检测，结果显示泥底中MG在0～270 d一直维持在(0.50±0.01)～(1.83±0.01)μg/kg范围内，而LMG呈现出近似于蓄积的趋势，起始含量小于0.5 μg/kg，随后含量逐步增高，直至360 d出现最高含量(5.92±1.23) μg/kg；水样中LMG 除在第1、3、15 天检出，其余均未检出。而 MG在水样中的变化更为直观，第1 天质量浓度最高为(46.44±7.39) μg/L，随后急剧降至1 μg/L左右，并保持稳定。由此可推测，养殖水体中 MG和LMG残留量迅速下降，底泥可吸附水体中MG。本研究中，次年将阳性池塘中的水换掉后再次放养麦鲮，其肌肉中仍有MG和LMG检出，说明使用过MG的池塘难以在短时间(1～2年)内彻底清除MG，对养殖对象产生一定的影响。

图1 首次放养麦鲮肌肉中MG和LMG残留量的变化(n=4)Fig.1 The changes of residues of malachite green and leucomalachite green in Cirrhina mrigola muscles in the first year (n=4)

表5 MG浸染池塘次年放养鲮组织中MG和LMG的残留量Tab.5 Residues of MG and LMG in Cirrhina mrigola samples from pond pretreated with MG in the following year

取样时间/dSampling timeMG残留量/(μg·kg-1)Residues of MGLMG残留量/(μg·kg-1)Residues of LMG取样时间/dSampling timeMG残留量/(μg·kg-1)Residues of MGLMG残留量/(μg·kg-1)Residues of LMG01.58±0.753.10±2.31401.80±2.5822.92±8.5611.68±4.8115.62±5.24501.43±2.4517.85±0.2522.28±2.6542.65±6.57702.02±1.0127.00±4.5654.88±1.23105.30±8.2590ND18.40±9.35104.98±2.01101.80±9.12120ND7.05±1.03154.35±1.2376.50±10.78150ND1.48±0.29203.15±3.0250.45±1.23180NDND302.40±2.3120.85±3.24210NDND

注：ND代表未检出。

图2 次年放养麦鲮肌肉中MG和LMG残留量的变化(n=4)Fig.2The changes of residues of malachite green and leucomalachite green in Cirrhina mrigola muscles in the following year (n=4)

3 讨论

3.1 受试对象的选择

麦鲮属底层鱼类，适应性强，食性杂，产量高，无论在池塘还是在山塘、江河都能正常生长。麦鲮作为名贵淡水鱼鳜的饵料鱼，在鳜养殖产业中广泛应用。由于过去MG的危害不为人熟知，其在水产养殖中常用于预防或治疗水霉、寄生虫等疾病，造成了MG在环境中的残留。通过测定MG阳性环境中养殖麦鲮体内有无MG或LMG残留，不但可说明使用过MG的养殖池塘对养殖麦鲮是否有影响，而且还可为探明经MG阳性环境池塘养殖的麦鲮是否会造成以其为饵的名优鱼类体内MG及其代谢产物LMG的残留提供参考依据。故本研究以麦鲮为受试对象，探讨在模拟人工养殖条件下，麦鲮在MG阳性环境中是否存在富集效应，为市场监督抽查中麦鲮阳性样品的MG可能来源提供参考，为加强对MG的监督和管理工作提供理论依据，为水产品质量安全风险评估提供技术支撑。

3.2 首次放养麦鲮肌肉中MG及LMG变化趋势

0～1 d，麦鲮肌肉 MG残留量逐渐上升，2 d时MG和LMG残留量结果变化较大，3 d后逐渐达到动态平衡，这可能因为麦鲮体内对MG的富集和消除达到动态平衡。张彤晴等[23]研究结果表明，不同浓度MG水溶液经30 d后，底泥中MG的残留量随时间推移逐渐上升，且底泥中MG以及LMG残留量与水体初始MG浓度成正相关关系。本实验在自然条件下进行，实验过程中环境变化(降水或干旱)造成池中水面的自然上升或下降，不会影响底泥中的MG和LMG含量变化，水体中基本无MG和LMG检出。本实验目的之一在于验证使用过MG的养殖池塘对养殖麦鲮是否有影响，进而为高端鱼类鳜的健康养殖提供参考。因时间及样品量的限制，并未对与肌肉样品采集相应时间点的水体及底泥进行采集，因此未能对两年的残留数据进行全面的比较分析。后续实验中可考虑增加环境样品的采集，充实数据以完善相关研究。

3.3 次年放养麦鲮肌肉中MG及LMG变化趋势

次年同一池塘再次放养麦鲮后,从0～30 d，麦鲮肌肉 MG残留量为(1.58±0.75)～(4.98±2.01) μg/kg，直到90 d后未检出， LMG从0～30 d残留量为(3.10±2.31)～(105.30±8.25)μg/kg，随后波动式下降直至180 d时低于定量限(0.50 μg/kg)。而首年0～30 d ，麦鲮肌肉MG残留量范围为(74.75±0.75)～(835.20±1.28)μg/kg， LMG为(122.40±3.24)～(6 244.00±8.24)μg/kg。两次放养麦鲮体内LMG残留量都是先上升随后下降到某个值后达到平衡，而MG残留量水平相较于LMG一直处于较低水平。次年池塘养殖麦鲮体内的MG和LMG残留量水平远低于首年放养麦鲮体内残留， 这可能是池塘中MG残留量通过鱼体消除、换水、光照和生物降解等方式减少。次年池塘通过换水再次放养麦鲮后仍能检出MG和LMG，这说明池塘水体中MG和LMG可能被底泥吸附。张彤晴等[23]的研究指出，在有底泥的池塘中，水体中绝大部分MG和LMG被底泥吸附，其研究结果与本研究一致。本研究表明，使用过MG的养殖池塘对麦鲮的养殖确有影响，如果以之作为其他肉食鱼类如鳜、笋壳鱼(Oxyeleotrismarmoratus)等的饵料鱼，可能会造成肉食鱼类体内MG或LMG残留风险。如果养殖户在大塘中违法使用MG，由此造成对池塘底质的影响将是长远的。清塘、翻耕、曝晒不仅能杀灭底泥中的有害病菌，阳光还有降解水体及底泥中MG的作用[23]，因此，水产养殖中清塘过程非常重要。应采用翻耕、暴晒及微生物制剂综合降解MG来提高养殖产品质量和安全，增强中国水产品在国际市场上的竞争力。

4 结论

本研究模拟自然养殖条件，全池泼洒1 mg/L MG，放置7 d后，换水并放养麦鲮。建立高效液相色谱—串联质谱法测定麦鲮肌肉组织中MG 和LMG残留量。方法的检出限和定量限均为0.5 μg/kg。

对连续两年度的放养实验中麦鲮肌肉中的MG和LMG代谢规律研究表明，首次放养，0～30 d肌肉中MG残留量先随时间波动式上升后逐渐下降，至160.00 μg/kg左右达动态平衡；同时肌肉中LMG残留量以同样的趋势至3 370.00 μg/kg左右，并达动态平衡。次年相同池塘再次放养与首年体长、质量相近的麦鲮后，0 ～ 70 d期间，其体内MG一直维持在(1.43±2.45)～(4.98±2.01)μg/kg，直到90 d后未检出； LMG在0～5 d残留量从(3.10±2.31)μg/kg上升到(105.30±8.25)μg/kg，随后波动式下降，直至180 d低于定量限(0.50 μg/kg)。

综上说明，养殖池塘中若使用过MG，有可能会造成养殖鱼类特别是底栖鱼类(麦鲮)体内MG及LMG残留，次年180 d才低于检测限。若将这些底栖鱼类(麦鲮)进一步作为其他肉食鱼类如鳜、笋壳鱼等的饵料鱼，可能会造成肉食鱼类体内MG或LMG残留风险。对于底泥中有残留MG的池塘应当禁养麦鲮。