麻风生物样本库的建立和应用

王真真 刘 红 王 川 于功奇 付希安 暴芳芳 孙勇虎 糜自豪 孙乐乐 潘 晴 初同胜 周桂芝 熊 立 杨 军 杨荣德 李进岚 柯 伟 宁 湧 熊俊浩 黎 明 熊明洲 杨 斌 段启志 王 宏 李 伟 旷燕飞 李俊华 王腊梅 操秋阳 肖 鹏 肖邦忠 张连华 蔺兆星 王耀斐 沈云良1 严丽英1 武文斌1 郑 虎1 占先发1 李旺华1 尚修建1 许玉军1 刘 巧1 严良斌 张国成 陈树民 张福仁,22

麻风是由于麻风分枝杆菌感染易感个体，侵犯皮肤和外周神经的慢性传染病，晚期可导致畸残。自上世纪80年代以来，由于治疗学上的进步使现症病人显著减少[1]。自上世纪末，我国多数省市已达到世界卫生组织(WHO)和我国政府控制麻风的标准，但由于缺乏一级预防措施，在达标后的10余年里，全国新发麻风病例并无明显减少，麻风所导致的畸残依然存在。为消除麻风危害，卫生部联合十一部委联合下发了“消除麻风危害中长期规划(2011-2020)”[2]。

麻风的危害表现主要表现为致残和在治疗过程中发生的重症药物不良反应所导致的死亡。欲从根本上消除麻风危害，只有在基础研究领域取得重大突破。有效的生物样本是开展基础研究和国际合作的前提。

有鉴于此，研究团队自2005年开始在省内外收集麻风生物样本，以生物样本为基础开展了系列研究并取得预期结果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备 立式-80℃冰箱(SANYO,MDF-U73V；Thermo Fisher,88700V62)；卧式-20℃冰箱(澳柯玛，DW-25W525)；标签打印机(BRADY，BP-IP300)；低温离心机(Eppendorf,5430R)；各种规格移液器(Eppendorf)；电泳仪(EC3000-90)；凝胶成像系统(Tanon,4100)；高通量微量紫外可见光光度计(Nanodrop8000)；核酸提取仪(KURABO,QuickGene-610L；天根生化，TGuide-M16)。

1.1.2 试剂 全血总DNA提取试剂盒(QuickGene DNA whole blood kit；TGuide 大体积血液基因组DNA提取试剂盒)。

1.1.3 耗材 1.5 mL离心管、各种规格吸头(Axygen)；5ml抗凝采血管、促凝管(山东威高)；专用冻存盒(AVANTECH)；拭子(扬州晓康医疗器械有限公司)。

1.1.4 软件 样本库管理软件(山东艾创信息技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样本采集前准备工作

1.2.1.1 伦理申请 项目负责人向山东省皮肤病性病防治研究所伦理委员会提出伦理申请，通过伦理委员会审批。

1.2.1.2 样本采集对象 根据全国麻风病防治管理信息系统录入的麻风患者信息，导出全国麻风患者数据，然后委托各省市麻风防治工作人员进行摸底调查，确定具体样本采集数量和地点。

1.2.2 样本采集入库流程

1.2.2.1 知情同意 在样本采集之前，需要麻风患者充分了解样本采集的种类，数量和样本用途，签署知情同意书。

1.2.2.2 样本采集 采集麻风患者样本，每例患者利用标准试管采集EDTA抗凝血1管，促凝血1管，鼻黏膜拭子2支(左右鼻孔各1支)，皮损组织1块(体积不大于0.5 cm3)，在所采集的每例样本管上做唯一标识用于暂时区分不同患者的样本。样本采集后立即保存于4℃条件，低温运输至实验室。

1.2.2.3 样本分离 采集到的促凝血样本需4000 rpm，离心5分钟分离血细胞与血清，待离心完毕，一次性移液管将上层血清样本转移至无菌冻存管中。采集到的抗凝血需利用QIAamp DNA Blood Mini Kit完全抽提为3份基因组DNA，共1 mL，保存至无菌离心管中。

1.2.2.4 样本入库 在样本分离处理完毕，根据实验室不同样本类型编号原则，对所采集样本编制唯一编号，反应样本数量、类型等指标，标签贴于保存管壁。

1.2.2.5 样本信息管理 将所采集样本的信息编制成EXCEL表格，导入至样本库管理软件“生物银行”中，然后与样本实现一一对应。

1.2.2.6 样本质量控制 随机抽取100份基因组DNA，移取3 μL利用1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，拍照分析DNA质量。

2 结果

2.1 样本的收集情况 从2005年至今已采集、处理、保存来自全国19个省份的标本81,532份。包括组织标本35,268份，血液标本33,320份，微生物标本(鼻黏膜拭子)12,944份。其中血液标本中麻风散发病例11,964例(多菌型8,135例，少菌型3,829例)，麻风家系396个(含标本1,918例)，对照全血标本19,438例(详见表1)；麻风散发病例和正常对照来自19个省份，其中42%麻风散发病例和64%的正常对照来自于山东省。其中麻风散发病例和正常对照来自汉、壮、彝等19个民族，汉族来源的样本在麻风散发病例和正常对照中所占比例分别为72%和88%(详见表2)；其中HLA-B*13:01阳性并发生氨苯砜综合征的患者104例，HLA-B*13:01位点阳性但未发生氨苯砜综合征的麻风患者1,725例。

所有样本经处理后保存于超低温冰箱中，临床资料和存储位置等信息全部导入样本库管理软件，实现了对样本储存信息的可视化管理，同时具有检索、归类等多种功能，可以在较短时间内搜寻目的样本。

表1 麻风生物样本库总样本量

表2 麻风散发病例及正常对照全血样本来源的民族分布

2.2 麻风生物样本库的应用 以上述生物样本为基础，成功获得国家自然科学基金(30771943、81072391、81071288、81101187、81271746、31200933、81371721、81402593、81472869、81472868、81573036、31601040、81602746、81601387、81703110、81701579)、973前期研究专项(2011CB512105)、863计划青年科学家专题(2014AA020505)、国际(地区)合作与交流项目(81620108025)、战略性国际科技创新合作重点专项(2016YFE0201500)以及省部级项目支持，先后开展了麻风病因学系列研究和重症药物不良反应风险因子研究，发现麻风系列风险因子和氨苯砜综合征风险因子，取得了一系列原创性成果(相关研究成果先后发表在《New England Journal of Medicine》[3,4]、《Nature Genetics》[5,6]、《The American Journal of Human Genetics》[7]、《Nature communications》[8]、《Human Molecular Genetics》[9]、《The Journal of investigative dermatology》[10]等国际知名学术期刊；获得国内外专利ZL201210372030.6、ZL201210372029.3、ZL201210375609.8、ZL201210407149.2、ZL201410531166.6、ZL201410532195.4、ZL201410531170.2、ZL201410531168.5、ZL201410531724.9、ZL201410531143.5、14110274.0、10-2014-7018133、14/370,465、11201403447V、2015-537106、P00201403711)。上述科学发现的及时转化使发现麻风高危个体从而实现精准化学预防成为现实，同时实现了对氨苯砜综合征的成功预防，有效消除了麻风危害。

资源库的建立和不断充实，不仅使本团队引领了麻风相关研究的国际大合作[3-10]，为国内外同行的研究提供了支持[11-18]及相关的生物信息学支持(dpGap study accession: phs000217.v2.p1)。

2 讨论

近年来，随着全基因组芯片扫描技术、高通量测序技术、各类组学与生物信息学的快速发展，个体化医疗、转化医学与精准医学成为国际医学前沿研究的重要概念。如何将基础研究成果应用于临床已成为科学研究成员关注的焦点，而高质量的样本来源是一切的物质基础，标准化的生物样本库是个体化医疗[19]、转化医学[20]与精准医学计划[21]的资源支撑。生物样本库的建立不仅有利于科学研究设计的整体规划，还提高了存储容器的利用率及取样效率。

麻风生物样本库具有来源广泛、种族丰富、数量充足、样本类型多样等特点，而且每一份样本都携带完整的临床信息。本样本库在收集麻风散发样本时，尤为注重与之年龄、性别、地域、民族匹配的正常对照样本的采集，这些标准大大提高了生物样本库样本的利用率。今后我们仍会延续前面的样本收集标准和流程，持续不断的收集麻风病例及匹配的正常对照，不断丰富麻风生物样本库。

麻风生物样本库不仅可供永久性研究需要，还抢救和保护了我国宝贵的遗传资源，为我国乃至人类保存了基因资源，更使我国占领了该领域的科学制高点。在本标本库建成之前，麻风病因学研究的重大发现被一直为欧美科学家所垄断[22-25]，自2009年本团队发表第一篇研究论著以来，该领域的研究一直为我国所引领[3-10]。

科学发现的及时转化加速了我国消除麻风危害的进程，提前实现了卫生部等11部委联合下发的《全国消除麻风病危害规划(2011-2020年)》(卫疾控发[2011]76号)[2]的目标，也为我国麻风防控技术走向国际、造福人类提供了契机，更为实现习近平总书记在第19届国际麻风大会的贺词中所指出的为“创造一个没有麻风的世界”(http://news.xinhuanet.com/2016-09/19/c_1119587381.htm)贡献了中国智慧。