UPLC-MS/MS法同时测定杜仲酒中9种成分含量

惠小娜，张晨宁，雷震，杨洋，马卫东，兰鸿，罗斌，杨光义

(1.十堰市太和医院药学部，十堰 442000；2.湖北世元杜仲保健酒业有限公司，十堰 442000；3.广东省深圳市宝安中医院，深圳 518000)

杜仲(Eucommiaulmoides)为杜仲科植物杜仲(EucommiaulmoidesOliver)的干燥树皮，又名思仙、思仲、木棉，为我国名贵滋补药材[1]。杜仲作为中药在我国已有2000多年的药用历史，具有补肝肾、强筋骨、降血压、抗肿瘤、安胎等诸多功效[2-3]。杜仲酒由干燥杜仲皮泡制而成，具有调节血压、降低血脂、滋阴补肾、强身健体、增强免疫力等功效[4-5]。文献表明杜仲中的活性成分松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷、紫丁香苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、咖啡酸、绿原酸、原儿茶酸等具有降血压、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等药理作用[6-8]，笔者通过对不同批次杜仲酒中各类活性成分的调查和研究，建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定杜仲酒中9种成分含量，可用于杜仲酒的质量控制，为其进一步开发和利用提供理论参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 WATERS XEVO TQ UPLC-MS/MS超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪，色谱工作站ACQUITY UPLC系统(美国WATERS公司)，GWA-UN超纯水机(北京普析通用有限公司)，AUW-120D分析天平(日本岛津公司，感量：0.01 mg)，Centrifuge 5427R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，VORTEX-6微型涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2试药 杜仲酒(湖北世元杜仲保健酒业有限公司，批号：20160704，20160910，20161103)，对照品松脂醇二葡萄糖苷(批号：MUST-16062204，含量：98.8%)、桃叶珊瑚苷(批号：MUST-16052017，含量：99.3%)、京尼平(批号：MUST-16042018，含量：99.7%)、京尼平苷(批号：MUST-16062016，含量：99.8%)、京尼平苷酸(批号：MUST-16042003，含量：99.7%)、咖啡酸(批号：MUST-16060613，含量：99.7%)、原儿茶酸(批号：MUST-16032112，含量：99.5%)均购于成都曼思特生物科技有限公司，紫丁香苷(批号：111574-200502，含量：99.6%，中国食品药品检定研究院)、绿原酸(批号：0753-200111，含量：99.8%，中国食品药品检定研究院)；乙腈(色谱级，德国Merck KGaA，批号：JA031530)；甲醇(色谱级，德国Merck KGaA，批号：1746607431)；甲醇(分析级，武汉市中天化工有限责任公司，批号：20160705)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1UPLC-MS/MS条件

2.1.1色谱条件 色谱系统：色谱柱：Waters HSS T3超高效液相色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流动相：甲醇(含0.1%甲酸，A)-水(含0.1%甲酸，B)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速为0.4 mL·min-1，柱温为40 ℃；进样体积5 μL。

表19种待测化合物洗脱程序表

Tab.1Elutionprogramforninecompoundsundertest

时间/min流动相A流动相B% 0595 ～0.5595>0.5～6.05→5595→45>6.0～7.555→545→95>7.5～8.0595

2.1.2质谱条件 Waters三重四级杆串联质谱仪(Waters Xevo TQ Triple Mass Spectrometer，Acquity UPLC，XEVO TQ)，电喷雾离子源(Electrospray ionization，ESI)，MassLynxV4.1工作站；毛细管电压3.8 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度500 ℃；喷雾气1000 L·h-1氮气(N2)；碰撞气0.16 mL·min-1氩气(Ar2)；扫描方式多反应正负离子同时监测模式(Multiple Reaction Monitoring，MRM)。9种待测化合物质谱条件见表2。

表29种待测化合物质谱条件

Tab.2MSparametersforninecompoundsundertest

成分母离子子离子(m/z)驻留时间/s锥孔电压碰撞电压V松脂醇二葡萄糖苷705.15543.160.026038桃叶珊瑚苷369.09203.010.023822紫丁香苷395.11232.770.023620京尼平225.05122.950.02146京尼平苷411.11217.000.023028京尼平苷酸373.15211.030.022812咖啡酸179.01106.890.022224绿原酸353.06190.980.022812原儿茶酸152.9980.890.022220

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷、紫丁香苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、咖啡酸、绿原酸、原儿茶酸9种标准品各5.00 mg，分别置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解，混匀，定容，分别制成1 mg·mL-1对照品储备液备用。

2.2.2供试品溶液的制备 分别取杜仲酒样品适量置于EP管中，14 000 r·min-1高速离心10 min，取上清液，经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液置EP管中，备用。

2.3HPLC定量分析方法学考察

2.3.1标准曲线的制备 取等体积对照品储备液混合，加甲醇定容，线性梯度稀释后，取5 μL按上述UPLC-MS/MS条件进样，记录峰面积。以溶液质量浓度(X)横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表3，表明各成分在各自范围内线性关系良好。色谱图见图1。

2.3.2精密度实验 取同一供试品溶液，进样5 μL，在“2.1”项色谱条件下连续测定6次，测得峰面积RSD分别为松脂醇二葡萄糖苷2.82%、桃叶珊瑚苷3.59%、紫丁香苷3.11%、京尼平4.38%、京尼平苷4.26%、京尼平苷酸3.75%、咖啡酸2.99%、绿原酸2.64%、原儿茶酸4.12%，结果显示其RSD均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.3.3重复性实验 按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，进样5 μL，测得峰面积RSD分别为松脂醇二葡萄糖苷3.02%、桃叶珊瑚苷3.59%、紫丁香苷2.47%、京尼平3.06%、京尼平苷4.13%、京尼平苷酸2.58%、咖啡酸3.79%、绿原酸2.96%、原儿茶酸4.52%，结果显示其精密度RSD<5%，表明该方法重复性良好。

表39种成分标准曲线、相关系数、线性范围及检测限

Tab.3Linearequation,correlationcoefficient,linearrangeandlimitofquantitationofninecompounds

成分标准曲线r线性范围检测限(ng·mL-1)松脂醇二葡萄糖苷Y=97.31X+3142.70.99937.68～4920.08桃叶珊瑚苷Y=76.03X+373.10.99976.75～4320.45紫丁香苷Y=215.67X+9376.30.99908.13～5200.07京尼平Y=121.31X+445.70.99927.62～4880.30京尼平苷Y=14.16X+118.50.99946.44～4120.52京尼平苷酸Y=256.64X+6828.40.99968.69～5560.17咖啡酸Y=22.39X+673.70.99936.06～3880.63绿原酸Y=499.06X+2788.90.99987.88～5040.29原儿茶酸Y=36.98X+439.00.99917.81～5000.38

2.3.4稳定性实验 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0，2，4，8，12 h进样5 μL，根据峰面积计算RSD，考察样品稳定性。样品中9种被测成分的峰面积RSD分别为松脂醇二葡萄糖苷3.54%、桃叶珊瑚苷2.38%、紫丁香苷4.91%、京尼平3.88%、京尼平苷2.73%、京尼平苷酸1.98%、咖啡酸3.26%、绿原酸2.85%、原儿茶酸4.03%，结果显示RSD均<5%，表明供试品溶液于12 h内稳定性良好。

2.3.5加样回收率实验 精密量取已知含量的杜仲酒样品9份，每份1.0 mL，分别准确加入样品含量的80%，100%，120%的对照品，混匀，按照“2.1”项下色谱方法进样测定，计算低、中、高浓度水平的回收率实验，结果见表4。结果显示，9种成分在低浓度回收率为98.33%～100.02%，RSD<4.88%，中浓度回收率为97.83%～101.45%，RSD<4.76%，高浓度回收率为98.58%～100.36%，RSD<4.79%，表明本法有良好的准确性。

A.空白样品；B.对照品；C.供试品

Tab.4Resultsofrecoverytestofnineconstituents%，n=3

成分低浓度回收率RSD中浓度回收率RSD高浓度回收率RSD平均RSD松脂醇二葡萄糖苷99.632.05101.451.49100.361.981.84桃叶珊瑚苷98.894.88100.884.7699.374.794.81紫丁香苷100.023.3099.753.0799.653.353.24京尼平99.493.3498.733.2698.583.093.23京尼平苷98.784.1198.634.0299.043.783.97京尼平苷酸99.902.2699.691.9999.392.202.15咖啡酸99.272.5897.832.4998.942.912.66绿原酸98.330.7599.670.6799.620.770.73原儿茶酸99.912.6598.942.9798.882.872.83

2.3.6样品含量测定 取杜仲酒样品3批，批号20160704，20160910，20161103，分别编号1-1，1-2，1-3，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，分别进样5 μL，测定峰面积，代入回归方程，计算待测物中9种成分在杜仲酒中的含量，结果见表5。

表5杜仲酒中9种指标成分的含量测定结果

Tab.5ResultsofcontentdeterminationonnineingredientsinEucommiawine

μg·mL-1，n=3

3 讨论

3.1检测方法选择 笔者在本实验曾采用HPLC-UV法测定，但由于部分成分的含量较低，响应信号不明显，而且复杂多样，各成分间相互干扰严重，多种成分含量同时测定色谱条件摸索困难，以致该方法的灵敏度和选择性都不足以同时定量分析[9-10]。故在查阅文献[11-14]的基础上，采用UPLC-MS/MS法进行测定，由于质谱采用特定离子对扫描模式，样品中杂质不会对待测成分产生干扰，并且克服了液相色谱分离度差的问题，在短时间内即可达到有效分离，又能保证待测成分快速检测。

3.2色谱、质谱条件选择 笔者在本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸-乙腈，发现采用甲醇(含0.1%甲酸)-水(含0.1%甲酸)为流动相时，各成分均显示出较高的检测灵敏度和较好的峰形。同时，采用梯度洗脱程序可大大提高了分离速度和效率，在7 min内即可实现9种成分的有效分离。

本实验建立了一种UPLC-MS/MS的检测方法，能够同时检测杜仲酒中松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷、紫丁香苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、咖啡酸、绿原酸、原儿茶酸这9种目标化合物的含量。利用标准样品建立的标准曲线相关性系数0.9990～0.9998，说明对9种目标化合物的定量可靠，最低检测限为0.07～0.63 ng·mL-1，说明该检测方法灵敏度高。实验采用的UPLC-MS/MS法利用其能够快速简便的对样品进行定性及定量研究的特点，对不同批次杜仲酒中有效成分的含量进行测定，操作简单且灵敏度高。在本实验色谱条件下可快速、准确地同时测定出杜仲酒中多种主要成分的含量，可为该酒的质量控制提供有效的检测手段，并为其质量标准的建立奠定基础。