高乌甲素脂质体凝胶镇痛抗炎作用与皮肤刺激性*

徐蕾，杨爱霞，肖卫红

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

高乌甲素(lappaconitine，LA)是从毛茛科植物高乌头根中提取的难溶性二萜类生物碱，具有良好的镇痛抗炎效果，应用前景较广泛。但高乌甲素水溶性极差，半衰期短，治疗窗窄[1]，血药浓度存在峰谷现象，对黏膜有较强刺激性，注射时易引起局部不适[2]，普通剂型难以克服这些缺陷。经皮给药脂质体具有生物相容性、缓释性、增溶等特点[3]，是近年来研究的热点。笔者在本实验以脂质体为载体制备高乌甲素脂质体，并比较高乌甲素脂质体凝胶与高乌甲素凝胶给药效果。

1 材料与方法

1.1试剂 高乌甲素原料(上海三新研究所，批号：20161006，含量：98.6%)；无水乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司，含量>95%，批号：201403)；胆固醇(上海山浦化工有限公司，含量：95%，批号：201404)；卵磷脂(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170401，含量≥99%)；卡波姆(山东优索化工科技有限公司，批号：16040605)；三乙醇胺(天津市风船化学试剂科技有限公司，含量：85.0%，批号：201206)；甲醇(西陇科学股份有限公司，含量≥99.5%，批号：201611)；甲醛(湖北奥生新材料科技有限公司，含量：37.0%～40.0%，批号：110908)；纯化水为自制三蒸水。大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号：AKOO17DECO4016)、白细胞介素2(IL-2)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号：AKOO17DECO4017)。弗氏完全佐剂 (美国Sigma公司，批号：1002431819)。

1.2仪器 BS124S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司，感量：1 mg)；pH酸度计(上海仪电科学仪器)；MK3型酶标仪(热电上海仪器有限公司)。

1.3实验动物 昆明种(KM)小鼠，实验动物合格证号：42000600025229，42000600025518；Wistar大鼠，实验动物合格证号：42000600025813；日本大耳白兔，实验动物合格证号：42000600025722。均由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物许可证号：00264380。

1.4试药的制备

1.4.1高乌甲素脂质体的制备 精密称取高乌甲素36 mg，卵磷脂320 mg，胆固醇40 mg，置于茄形瓶，加入二氯甲烷(CH2Cl2)10 mL超声溶解，旋蒸去除溶剂(23 ℃，140 r·min-1)，使其在瓶壁形成均匀透明薄膜[4]；10 mL、55 ℃、pH值7磷酸盐缓冲液(PBS)旋转洗膜，搅拌水化3 h，水浴恒温55 ℃，得脂质体粗品后超声震荡约3 min，即得，4 ℃冰箱保存。

1.4.2脂质体凝胶的制备 称取0.18 g卡波姆940，将其均匀分散于8 mL纯化水中溶胀过夜，得基质，三乙醇胺调节pH值至6.5～6.8。将高乌甲素脂质体10 mL与基质混合均匀，即得到卡波姆940含量为1.0%的粘稠高乌甲素脂质体凝胶，4 ℃冷藏保存。

1.4.3高乌甲素凝胶的制备 将0.18 g卡波姆均匀撒于10 mL纯化水上，同“1.4.2”项法制备凝胶，将高乌甲素36 mg用乙醇2 mL溶解，加纯化水至18 mL，充分搅拌。

1.4.4空白凝胶的制备 将0.18 g卡波姆均匀撒于10 mL纯化水上，溶胀过夜，调节pH值至6.5～6.8即得。

1.5实验原理及方法

1.5.1热板实验 高乌甲素通过抑制电压依赖性Na+-Ca2+通道，抑制突触前膜对去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺(5-HT)的再摄取，增加两者在突触间隙含量，抑制传入神经纤维P物质释放[5]，发挥阻碍中枢神经系统电信号传导作用，从而实现镇痛效果。小鼠热板实验可从中枢神经方面考察高乌甲素脂质体凝胶作用效果[6]。

取KM雄性小鼠30只，体质量(20±2) g。实验室温度 20～24 ℃，相对湿度 40%～70%[7]。将小鼠置于(55.0±0.5) ℃热板测痛仪上，记录自放入至小鼠舔后足所需时间(s)，计为该鼠给药前基础痛阈值[8]。筛选出30 s内舔足小鼠，随机分为3组：空白对照组、高乌甲素脂质体凝胶组和高乌甲素凝胶组，8%硫化钠溶液腹部脱毛6 cm2，给药前再测1次痛阈值，取2次痛阈平均值作为给药前痛阈值。分别将空白凝胶、高乌甲素脂质体凝胶及高乌甲素凝胶0.15 mL涂于腹部，用药后0.5，1，2，4 h测定痛阈。

1.5.2扭体实验 高乌甲素能通过抑制脑导水管周围灰质和皮质细胞Ca2+内流以及核因子κB表达，发挥周围镇痛作用[9]。笔者在本实验以小鼠扭体实验从周围神经方面考察高乌甲素脂质体凝胶作用效果。

取KM雄性小鼠30只，同“1.5.1”项饲养条件，随机分为3组，即空白对照组、高乌甲素脂质体凝胶组和高乌甲素凝胶组。腹部硫化钠脱毛，分别涂药品，药物与剂量同“1.5.1”项。连续5 d。第5天用药后1 h，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL，以引起扭体反应(腹部内凹，臀部高起)，测定给药后10，15 min内小鼠扭体次数。

1.5.3大鼠抗炎实验 有研究表明，高乌甲素对甲醛、佐剂、二甲苯等炎症模型有良好的的治疗效果[10-11]。大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA) 模型为灭活的结核分枝杆菌诱导的T细胞介导的免疫亢进性炎症模型[12-13]，AA大鼠模型是成熟模型，也是研究类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)常用模型。RA发病过程与多种细胞因子有关，如非酶促因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等[14-15]。RA患者体内TNF-α、IL-2水平上调，刺激内皮细胞产生黏附分子，黏附分子与白细胞作用，导致炎症反应更强烈，且刺激纤维母细胞增殖[16]，影响生成骨细胞所需蛋白，从而破坏骨组织。降低TNF-α能减缓对软骨的破坏[17]。笔者在本实验通过大鼠AA实验考察高乌甲素脂质体凝胶抗炎效果。

取SPF 级Wistar雄性大鼠30只，体质量约200 g，在(24±2)℃、光照周期12 h环境适应性饲养1周。每只大鼠右后肢踝关节周围以记号笔做出环形标记，致炎前1 d用手术线绕足围一周测量足周长。每只大鼠右后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL以制备AA大鼠。第14天再次测量足围，与致炎前比较，增加0.5 cm即造模成功。将造模成功的大鼠以随机数字表法分为模型对照组、高乌甲素脂质体凝胶组、高乌甲素凝胶组。模型对照组大鼠右后足趾均匀涂布空白凝胶0.25 mL，其他两组分别涂布高乌甲素脂质体凝胶和高乌甲素凝胶0.25 mL，早晚各1次，均给药1周。

1.5.4皮肤刺激性实验 取健康白兔8只，体质量2.0～2.5 kg，眼科手术剪背部对称脱毛2块，每块面积为5 cm×5 cm。分为完整皮肤组与破损皮肤组。破损皮肤组右侧用#400细砂纸在脱毛部位制备擦伤，使皮肤出现密集出血点。每只白兔左侧作为空白对照涂抹空白凝胶，完整皮肤组与破损皮肤组右测涂抹高乌甲素脂质体凝胶2.5 mL，24 h内涂药两次，涂完敷保鲜膜，胶带固定，24 h后洗去残留药物。

1.6观察指标与观察方法

1.6.1观察指标 体征：观察大鼠致炎后毛发、行为、足肿胀等变化；足围：致炎后每3～4 d同一时间、地点测量大鼠足围。治疗给药当天记录未给药时大鼠右后足周长，以后每隔2 d测量右后足周长，取第1，3，5，7天数据结果。生化指标：给药第7天禁食16 h，第8天经眼眶取血分离血清，酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定TNF-α、IL-2含量[16，18]。病理切片：麻醉后处死大鼠，剪下右后足炎性踝关节，小心剥离皮肤、肌肉组织，保留完整关节部分。甲醛固定，不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋、切片(厚度4～7 μm)、进行苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜观察组织病理变化[19-20]。

1.6.2皮肤刺激性评价标准 观察兔皮肤在洗去药物后1，24，48 h至第7天皮肤反应，按照表1进行评分。

表1兔皮肤刺激性实验评价标准

Tab.1Evaluationcriteriaforskinirritationtestinrabbits

红斑分值平均分值评价无红斑00.0～0.49无刺激极少数红斑10.5～2.99轻度刺激中度红斑23.0～5.99中度刺激大面积红斑36.0～8.0严重刺激紫红色红斑并形成焦痂4

2 结果

2.1热板实验 见表2。给药前，3组小鼠痛阈值差异无统计学意义；高乌甲素凝胶组和高乌甲素脂质体凝胶组2，4 h痛阈值均大于同时间点空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；高乌甲素脂质体凝胶组2，4 h痛阈值大于高乌甲素凝胶组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；给药后0.5 h，3组差异无统计学意义；给药后1 h，高乌甲素凝胶组和高乌甲素脂质体凝胶组高于空白对照组，高乌甲素凝胶组和高乌甲素脂质体凝胶组差异无统计学意义；给药后2，4 h，高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组痛阈分别提高34.3%和125.8%。由表2可知，随着给药时间延长，高乌甲素脂质体凝胶组痛阈值明显延长且明显大于高乌甲素凝胶组，提示脂质体凝胶有缓释作用。

2.2扭体实验 与空白对照组比较，给药后10，15 min，高乌甲素凝胶组、高乌甲素脂质体凝胶组扭体次数显著减少，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。给药后10 min内，高乌甲素凝胶组扭体次数少于高乌甲素脂质体凝胶组，差异无统计学意义；给药后15 min内，高乌甲素脂质体凝胶组扭体次数少于高乌甲素凝胶组，差异无统计学意义。见表3。

2.3抗炎实验

2.3.1大鼠表现 致炎第2天，大鼠右后足掌整体明显红肿，足趾肿胀，足围及足厚度明显增加。见图1。致炎期间大鼠毛发光泽度差，行走轻微障碍，舔足次数增多。

2.3.2足围造模期间足围变化 见表4，给药前各组足围无明显差别。与造模前比较，造模第14天足围均增加>0.5 cm(P<0.01)，提示造模成功。给药后每2～3 d测量足围，结果见表5。与模型对照组比较，高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组足围有变小趋势，且在第4天，高乌甲素脂质体凝胶组足围较模型对照组明显变小，差异有统计学意义(P<0.05)；给药第7天，与模型对照组比较，高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组均差异有统计学意义(P<0.01)，且高乌甲素脂质体凝胶组足围小于高乌甲素凝胶组(P<0.01)。

2.3.3血清生化指标 ELISA法测得标准曲线值，经软件计算得到TNF-α：Y=0.000 2X+0.011 0，r=0.996 1；IL-2：Y=0.000 7X+0.004 1，r=0.994 2，酶标仪测得吸光度值(A)值，代入公式后得到血清中大鼠TNF-α、IL-2浓度(pg·mL-1)，结果见表6。造模21 d后高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组TNF-α、IL-2浓度较模型对照组下降，且差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与高乌甲素凝胶组比较，高乌甲素脂质体凝胶组TNF-α与IL-2浓度显著降低(P<0.05)。

表23组大鼠热板实验给药前后痛阈值测定结果

Tab.2Resultsofpainthresholdbyhotplatetestinthreegroupsofratsbeforeandafteradministration

组别给药前痛阈给药后0.5 h给药后1 h给药后2 h给药后4 h空白对照组22.90±5.3228.90±7.0623.80±4.3727.00±7.0927.30±6.96高乌甲素凝胶组22.56±5.6025.44±4.3631.33±6.65*128.11±6.81*136.67±11.74* 1高乌甲素脂质体凝胶组21.09±3.9127.64±7.2029.64±8.30*138.73±15.45*1*261.64±28.34*3*4

与空白对照组比较，*1P<0.05，*3P<0.01；与高乌甲素凝胶组比较，*2P<0.05，*4P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.05,*3P<0.01；Compared with lappaconitine gel group,*2P<0.05,*4P<0.01

表33组小鼠给药前后扭体次数测定结果

Tab.3Resultsofwrithingtimesinthreegroupsofmicebeforeandafteradministration

组别10 min内扭体次数15 min内扭体次数空白对照组22.00±8.4939.6±13.0高乌甲素凝胶组9.54±9.43*121.0±16.2*2高乌甲素脂质体凝胶组11.70±9.01*218.0±13.6*1

与空白对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with blank control group,*1P<0.01,*2P<0.05

2.3.4踝关节病理切片 见图2。放大相同倍数，可见模型对照组切片关节腔狭窄，滑膜组织增生、充血且伴有大量炎细胞浸润，结缔组织增生，出现较多血管翳，软骨破坏明显。与模型对照组与高乌甲素凝胶组比较，高乌甲素脂质体凝胶组关节腔较宽，结缔组织排列较规则，炎细胞浸润减轻。提示高乌甲素脂质体凝胶抗炎效果更好。

2.4家兔皮肤刺激实验 按照评分标准，皮肤给药后1～7 d，兔完整与破损皮肤评分为0，均未出现刺激红肿现象。

3 讨论

小鼠热板实验中，2 h后高乌甲素脂质体凝胶组痛阈值较高乌甲素凝胶显著提高；扭体实验中高乌甲素凝胶组与高乌甲素脂质体凝胶组差异无统计学意义；佐剂实验发现，高乌甲素脂质体凝胶能显著降低血清TNF-α、IL-2含量。以上实验证明，在同等剂量下，随着给药时间的延长，高乌甲素脂质体凝胶镇痛抗炎效果明显强于高乌甲素凝胶，且脂质体可滞留于皮肤，增加药物在皮肤中的含量，从而形成释药储库，使高乌甲素脂质体达到缓释效果。以兔完整与破损皮肤刺激实验对高乌甲素脂质体凝胶进行安全性评价，显示该药温和无刺激。

图1大鼠致炎后(A)与致炎前(B)足部对比图

Fig.1Comparisonofthetoesofratsbefore(B)andafter(A)inducinginflammatory

实验过程中应注意，卡波姆放置时长链舒展引起pH值下降，使用时需测定pH值并用三乙醇胺调节pH值为6.5～6.8。小鼠用硫化钠脱毛后，需用0.9%氯化钠溶液清洗皮肤并恢复1 d再给药，防止对皮肤造成的损伤影响药物吸收。涂抹药物过程中小鼠易舔食药物，因此应待药物充分吸收后再放入饲养箱，大鼠足部抹药时用纱布与医用胶布包裹，以免其舔食。

本实验证实，高乌甲素脂质体凝胶有一定疗效且有缓释效果，但其体内分布及代谢情况需进一步研究。

表43组大鼠造模期间足围变化

组别造模前造模第4天造模第7天造模第10天造模第14天模型对照组2.191±0.0852.762±0.1372.808±0.0982.771±0.0732.825±0.080高乌甲素凝胶组2.188±0.0562.841±0.1912.919±0.1822.778±0.0832.787±0.099高乌甲素脂质体凝胶组2.193±0.0542.822±0.3352.859±0.1222.865±0.1252.819±0.094

表53组大鼠给药前后足围变化

组别给药前给药后第2天给药后第4天给药后第7天模型对照组2.825±0.0802.752±0.0452.734±0.0272.774±0.047高乌甲素凝胶组2.787±0.0992.722±0.1112.670±0.1002.638±0.091*1高乌甲素脂质体凝胶组2.819±0.0942.703±0.0682.645±0.041*22.554±0.042*1*3

与模型对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05；与高乌甲素凝胶组比较，*3P<0.01

Compared with model control group,*1P<0.01,*2P<0.05; Compared with lappaconitine gel group,*3P<0.01

表63组大鼠血清TNF-α和IL-2测定结果

Tab.6DeterminationofserumTNF-αandIL-2inthreegroupsofrats

组别TNF-αIL-2模型对照组234.64±28.4436.01±4.67高乌甲素凝胶组187.34±23.92*131.80±4.34*1高乌甲素脂质体凝胶组156.07±16.28*2*327.89±2.91*2*3

与模型对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与高乌甲素凝胶组比较，*3P<0.05

Compared with model control group,*1P<0.05,*2P<0.01; Compared with lappaconitine gel group,*3P<0.05

图2 3组大鼠踝关节病理特征(HE，×200)

Fig.2Pathologyofanklejointinthreegroupsofrat(HE，×200)

佐剂关节实验证实，高乌甲素能下调TNF-α、IL-2，从而发挥抗炎效果，这为研究高乌甲素抗炎作用机制提供了基础。脂质体凝胶剂为近年研究的热点，能提高药物局部浓度，增加药物的稳定性，改善患者顺应性，受到研究者青睐。本实验结果可为高乌甲素脂质体制剂的开发提供新思路。