黄芩及其提取物中黄芩素成分分析标准物质的研制*

邢逞，张丽，马林，龚宁波，杜冠华，吕扬

(北京协和医学院，中国医学科学院药物研究所1.药物晶型研究中心，晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050；2.药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050)

黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，是2015年版《中华人民共和国药典》[1]收载的中药材品种，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，临床用于湿温、暑湿、胎动不安等的治疗[2]。黄芩药材作为主要成分被用于安宫牛黄丸、安坤赞育丸、八宝坤顺丸、参茸白凤丸等中成药[3]，黄芩中药材质量直接关系到中成药产品质量。因此，需要对黄芩中药材的有效成分进行质量控制[4-5]。

用95%乙醇提取中化学成分是研究中草药中活性物质的主要提取方法，而水煎法是数千年来中药材在临床疾病治疗时的主要用药方式，95%乙醇提取物和水提取物中均含有治疗疾病的活性化学物质。因此，研制中药材95%乙醇提取物及水提取物标准物质，并以黄芩素作为指标成分定值，具有科学意义和实际应用价值[6]。

笔者在本实验完成了黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分分析国家级标准物质的研制，确定了药材、醇提物、水提物3种不同基质中黄芩素成分含量的标准值与不确定度值[7]。黄芩及其提取物中黄芩素成分分析标准物质的研制，可为我国黄芩中药材及中成药研制和产品质量控制提供物质基准。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司，DAD检测器，Agilent chemstation工作站；XS105型电子分析天平(Mettler公司，感量：0 g≤m≤5 g，0.01 mg；5 g

1.2国家一级标准物质黄芩素 化学纯标准物质，证书编号：GBW09516，纯度标准值及不确定度值(99.72±0.25)% (k=2)(中国医学科学院药物研究所研制)。

1.3中药材及其提取物

1.3.1黄芩中药材 产地河北省，经中国医学科学院药物研究所马林教授鉴定为正品，质量检查符合《中华人民共和国药典》2015年版规定要求[1]。黄芩中药材经除尘、粉碎、并过筛孔内径(250±9.9) μm(65目)筛，备用。精密称取样品1 g置棕色安瓿瓶密封包装，共完成500支最小包装1 g量的黄芩中药材成分分析标准物质候选物样品的制备工作。

1.3.2黄芩95%乙醇提取物 取黄芩中药材，粉碎后以5倍量95%乙醇作为提取溶剂，经加热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，真空干燥，粉碎并过筛孔内径(250±9.9) μm(65目)筛，得棕红色干粉，即为黄芩95%乙醇提取物，备用。精密称取样品100 mg，置棕色安瓿瓶密封包装，共完成500支最小包装100 mg量的黄芩95%乙醇提取物成分分析标准物质候选物样品的制备工作。

1.3.3黄芩水提取物 取黄芩中药材粉碎，加入6倍量纯净水，煎煮1 h，滤过，得提取液，将药渣加入与提取液等体积的纯净水，煎煮1 h，滤过，再次向药渣中加入与提取液等体积纯净水，继续煎煮1 h，滤过。合并上述提取液，水浴挥干后，75 ℃真空干燥，得棕色粉末，即为黄芩水提取物，备用。精密称取100 mg样品置于棕色安瓿瓶密封包装，共计完成了500支最小包装100 mg量的黄芩水提取物成分分析标准物质候选物样品的制备工作。

1.4试剂 甲醇(Fisher Chemical，色谱纯)，磷酸(分析纯，北京化学试剂公司)，娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1含量测定

2.1.1色谱条件 Agilent XDB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 mm)；流动相：甲醇：0.4%磷酸=51：49；梯度洗脱程序：0～17 min(51%甲醇)；17～25 min(51%→70%甲醇)；后运行5 min；流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量10 mL；检测波长275 nm。

2.1.2溶液的制备 标准储备液制备方法：精密称取黄芩素化学纯标准物质5.09 mg(按化学纯度99.72%计)，置于50 mL量瓶，用色谱级甲醇将样品完全溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成黄芩素为101.52 mg·L-1标准储备液。精密移取0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分别置于10 mL量瓶，用色谱级甲醇稀释至刻度，获黄芩素为1.0，5.1，10.2，20.3，50.8，101.5 mg·L-1标准溶液。

样品提取方法：精密称取黄芩中黄芩素成分分析标准物质样品100 mg、黄芩95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质样品30 mg、黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质样品30 mg，分别置具塞锥形瓶，精密加95%乙醇：盐酸=7：3混合溶液20 mL(95%乙醇提取物、水提取物为10 mL)，置90 ℃水浴中回流3 h，放冷，滤过，滤液置100 mL量瓶，用少量95%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀。准确量取1 mL，分别置10 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2方法学考察

2.2.1线性关系考察 分别精密移取6种不同浓度标准溶液10 μL，注入液相色谱仪，按照“2.1.1”项色谱条件，记录色谱图及峰面积。色谱峰面积分别为38.68，198.35，389.67，802.44，1982.56，4003.11，以黄芩素标准溶液浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，获得回归方程为Y=39.424X-4.8638(r=1.0000，n=6)。标准曲线实验结果表明，黄芩素标准溶液在1.0～101.5 mg·L-1范围内线性关系良好。

2.2.2精密度实验 精密吸取101.5 mg·L-1黄芩素标准储备液1 mL至10 mL量瓶，用色谱纯甲醇稀释至刻度。采用高效液相色谱法，按照“2.1.1”项色谱条件，重复测定6次，记录色谱图，黄芩素峰面积分别为369.68，369.82，369.33，369.47，369.60，369.66，RSD为0.05%，表明仪器精密度良好。

准确称取自制黄芩素纯度标准物质5.09 mg(按化学纯度99.72%计)6份，置50 mL量瓶，用甲醇将样品溶解，并定容至刻度，获得101.52 mg·L-1标准储备溶液。准确吸取1.0 mL置10 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度。采用高效液相色谱法，按照“2.1.1”项色谱条件，各重复进样3次，分别记录色谱图，获得黄芩素色谱面积均值/称样量为72.953，72.423，72.770，72.246，72.017，72.182，RSD为0.50%，表明实验方法精密度良好。

2.2.3重复性实验 分别称取黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物样品各6份，按照“2.1.2”项样品提取方法，按照“2.1.1”项色谱条件进行测定。黄芩中黄芩素含量分别为8.084%，8.160%，8.162%，8.174%，8.005%，8.284%，平均8.145%，RSD 1.15%；黄芩95%乙醇提取物中黄芩素含量分别为4.333%，4.301%，4.342%，4.282%，4.284%，4.292%，平均4.306%，RSD为0.60%；黄芩水提取物中黄芩素含量分别为9.165%，9.122%，9.021%，9.070%，8.873%，9.026%，平均9.046%，RSD为1.12%。表明黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物系列标准物质溶液制备方法重复性良好。

2.2.4回收率实验 分别称取黄芩中药材100 mg、黄芩95%乙醇提取物30 mg、黄芩水提取物样品30 mg各6份，分别加入黄芩素纯度标准物质作为加标样品。按照“2.1.2”项样品提取方法制备样品，采用HPLC法按照“2.1.1”项色谱条件测定黄芩素含量，计算回收率。黄芩中黄芩素回收率分别为100.50%，99.45%，98.64%，99.64%，99.77%，97.91%，平均回收率99.32%，RSD为0.92%；黄芩95%乙醇提取物中黄芩素回收率分别为100.89%，99.90%，98.79%，101.84%，98.34%，101.52%，平均回收率为100.21%，RSD为1.44%；黄芩水提取物中黄芩素的回收率分别为100.32%，99.47%，100.65%，101.63%，99.01%，99.02%，平均回收率100.02%，RSD为1.04%，结果表明方法回收率良好。

2.3均匀性实验 从500 支标准物质候选物中采用简单随机抽样方法抽取15 瓶样品，每瓶样品平行取样3 份，均按照“2.1.2”项样品提取方法，按照“2.1.1”项色谱条件测定黄芩素含量，分别获得45 个均匀性检验数据。黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物的均匀性数据见表1。

采用单因素方差分析(One Way Anova)[8]对均匀性数据进行组内和组间统计分析，测定黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素含量，F分别为1.24，1.21，1.29；均小于临界值[F0.05(14，30)=2.04]，即，F

2.4长期稳定性实验 将密封包装后的标准物质候选物样品放置在常温条件下长期保存，考察样品稳定性，并分别于0，1，2，4，6，12 个月随机抽样，每个点随机抽样6 瓶，按照“2.1.2”项样品提取方法，按照“2.1.1”项色谱条件测定黄芩素含量，实验测定结果见表2。以X代表时间(月)，以Y代表黄芩素含量值，分别拟合直线，获得直线方程，计算斜率的不确定度[9-10]，结果分别为：

表1黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分含量均匀性检验结果

Tab.1ResultsofuniformitytestonbaicaleincontentinScutellariaBaicalensisandits95%alcoholextractandwaterextract

成分1abc2abc3abc4abc5abc黄芩8.2828.3788.3308.4558.2538.4548.2178.1978.3087.7868.4498.1818.3998.2898.431黄芩95%乙醇提取物4.3634.3994.2884.2894.3644.3584.3174.3544.3614.3534.3774.4144.3184.3134.298黄芩水提取物9.3359.0219.0779.0289.2369.1279.2819.3778.7849.2628.7488.8909.4618.7218.854成分6abc7abc8abc9abc10abc黄芩8.4448.4858.3588.4788.4058.2298.4568.2488.6228.3618.3888.4138.4628.4238.210黄芩95%乙醇提取物4.3154.3554.4544.3954.3974.4184.4204.4214.3674.3844.3384.4374.4764.4104.308黄芩水提取物8.8708.9498.8908.7599.0318.6278.5679.3059.0119.0708.9179.0519.0579.4809.137成分11abc12abc13abc14abc15abc黄芩8.5398.0528.4408.2568.5588.0998.4188.5217.9917.7027.8888.3308.2188.4008.394黄芩95%乙醇提取物4.3354.4944.4064.3824.3764.4014.4084.3914.3064.4064.3364.4174.4184.4054.424黄芩水提取物9.0799.0549.3719.6808.8889.8558.9099.44110.2289.3208.6848.5698.9709.0368.742

黄芩水提取物中黄芩素：Y=0.000 08X+0.0935

2.5黄芩素含量标准值定值 依据国家标准物质技术规范[10]，采用6家实验室联合定值方法对黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分进行定值，定值数据见表3。采用格拉布斯检验，剔除可疑值，并采用科克伦(Cochran)等精度检验，证明黄芩素成分含量的测量数据均属等精度数据。计算获得6家联合定值的黄芩中黄芩素成分含量标准值P=7.952%，S=0.001 631；黄芩95%乙醇提取物中黄芩素成分含量标准值P=4.285%，S=0.000 408；黄芩水提取物中黄芩素成分含量标准值P=8.800%，S=0.002 375。

2.6不确定度评定

2.6.1成分含量标准值的不确定度评估 黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质的总不确定度由3个部分组成：测量标准值引入的不确定度、样品不均匀性引入的不确定度、样品稳定性引入的不确定度。其中，测量标准值引入的不确定度包含国家一级标准物质引入的不确定度、中药材及其提取物中有效成分提取及含量测定过程引入的不确定度以及联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度等。

2.6.2标准值的不确定度计算 ①黄芩素一级标准物质引入的不确定度值u(P)。黄芩素纯度标准物质的量值为(99.72±0.25)%，其标准不确定度值为0.25%/2=0.125%，相对标准不确定度值为u(P)=0.125%/99.72% =0.00125。②测量数据的不确定度值u(f)。利用测量数据计算：

表2黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分含量长期稳定性结果

Tab.2Resultsoflong-termstabilitytestonbaicaleincontentinScutellariaBaicalensisandits95%alcoholextractandwaterextract

%

表3 黄芩、黄芩 95% 乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素含量的联合定值

③联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度值urel。按照文献[11]规定，标准曲线拟合的标准偏差计算公式为：

S(y)：标准溶液峰面积的标准偏差；q：黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物溶液的测定次数；n：标准溶液的个数×每个标准溶液的测定次数；C0：标准溶液的浓度(mg·mL-1)；C1：中药材黄芩、95%乙醇提取物、水提取物溶液的浓度(mg·mL-1)；i：第n个校准溶液的第n次测量。以x代表检测样品的溶液浓度，以y代表检测样品的吸光度，分别拟合获得直线联合标定单位的标准曲线相对不确定度urel值，结果见表4。

比较6家单位获得的标准曲线相对标准不确定度值，取最大值分别为：黄芩中黄芩素成分含量标准曲线的不确定度urel=0.005 158，黄芩95%乙醇提取物中黄芩素成分含量标准曲线的不确定度urel=0.003 147，黄芩水提取物中黄芩素成分含量标准曲线的不确定度urel=0.014 94。

表4联合定值标准曲线引入的相对不确定度

Tab.4Relativeuncertaintyintroducedbystandardcurve

序号黄芩黄芩95%乙醇提取物黄芩水提取物10.002 1420.001 2860.006 40020.005 1580.003 1470.014 9430.004 7930.002 8970.014 1340.003 1790.002 0120.009 97550.003 8970.002 4790.011 8960.003 8120.002 3080.011 29

④合成标准不确定度计算，按照Uc(x)=

2.6.6扩展不确定度 由总合成标准不确定度计算扩展不确定度(U)，扩展因子k=2，黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质的扩展不确定度分别为0.222%，0.117%，0.398%。

2.7成分含量标准值及不确定度表示 在测量不确定度的最终计算中，一般采用只进不舍的规则。故黄芩中黄芩素成分分析标准物质定值结果为(7.95±0.23)%，k=2；黄芩95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质定值结果为(4.29±0.12)%，k=2；黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质定值结果为(8.80±0.40)%，k=2。

3 讨论

笔者在本实验通过采用单一化学成分标识复杂成分体系的量值传递技术路线，采用高效液相色谱法-多家实验室协作标定的方法，成功研制了黄芩中黄芩素成分分析标准物质GBW(E)090438、黄芩95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质GBW(E)090447、黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质GBW(E)090453，解决了中药材及其提取物等复杂体系中的相关化学成分的量值溯源性科学技术难题，为中药相同类型标准物质的研制起到了指导和示范作用。

笔者在本实验研制的黄芩及其提取物中黄芩素成分分析系列标准物质均含有准确的量值与不确定度，属国家二级计量有证标准物质，具量值溯源和量值传递功能，在国内外均属首次研制，填补了标准物质领域的品种空白。同时为提高我国中药材及中成药的质量标准、推动中药的标准化和现代化提供了标准物质、物质标准、标准技术方法。