miRNA-299-3p对肺癌细胞系A549迁移、增殖、凋亡、多柔比星敏感性的影响

汪洋，汪群，张峰

(湖北省肿瘤医院，武汉 430079)

肺癌是发病率与病死率较高的恶性肿瘤疾病，尤其对于男性患者，其发病率与病死率在各种恶性肿瘤中高居首位，且临床预后效果差[1～3]。化疗是临床上治疗肺癌的重要手段，其在改善手术患者预后、延长患者生存期等方面发挥重要作用。然而临床数据显示，不同肺癌患者对化疗的敏感性有明显差异，且不少患者在化疗过程中逐渐出现药物敏感性降低的现象，严重影响化疗效果[4,5]。近年研究[6]发现，许多对化疗药物出现耐受现象的肺癌患者同时伴随三磷酸腺苷结合盒E1(ABCE1)基因表达的上调，而抑制ABCE1基因的表达显著增加了多种肺癌细胞株对多柔比星的敏感性，为ABCE1作为肺癌耐药相关基因提供了直接证据，同时也表明ABCE1有望作为提高肺癌细胞化疗敏感性的基因靶点。 微小RNA(miRNA)对基因表达的调控非常重要，通常修饰成21～23个碱基长的短非编码核苷酸序列，通过与miR的3′非翻译区(3′UTR)中的部分互补序列杂交来调节靶基因表达，并阻断翻译或导致miR的降解[7～9]。miR-299-3p是一种具有重要调控功能的mRNA，其在恶性间皮瘤细胞中有差异表达[10]。文献[11]报道，miR-299-3p在人类干细胞中表达上调。此外，miR-299-3p已被描述为人脐静脉内皮细胞中复制衰老的重要因子[12]。研究[3]发现，ABCE1是miR-299-3p分子的下游重要靶基因之一，miR-299-3p的上调将显著抑制ABCE1基因的表达。本研究观察了miR-299-3p对人肺癌细胞A459迁移、增殖、凋亡、多柔比星化疗敏感性等生物行为的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肺癌A549细胞株购自美国ATCC细胞库；多柔比星、盐酸多柔比星购自美国Sigma公司，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Tunnel凋亡检测试剂盒购自中国凯基生物技术有限公司；ABCE1抗体、p-Akt抗体、Akt抗体、Caspase3抗体均购自美国Abcam公司；抗人GAPDH以及辣根酶标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；细胞培养孵箱购自美国Thermo公司；miRNA由Invitrogen公司合成；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

1.2 细胞培养和miR-299-3p细胞转染 取A549细胞放入RPMI1640培养基，添加10%胎牛血清，另添加100 U/mL青霉素与100 mg/L链霉素，在37 ℃、5%CO2培养条件下常规培养。细胞生长至90%以上汇合后，使用0.25%胰酶消化收集细胞，以1∶3比例进行传代扩增。A549细胞以1×105细胞/孔的密度接种于24孔板，继续培养24 h，待细胞汇合至90%以上时分为正常A549细胞组(对照组)、miR-299-3p转染组(miR-299-3p组)和随机序列转染的A549细胞组(随机miRNA组)，miR-299-3p序列分子以及对照的随机序列分子的转染使用LipofectamineTM2000转染试剂盒，按照生产商的说明书进行操作。

1.3 细胞ABCE1蛋白检测 采用Western blotting法。转染48 h后，分别收集“1.2中”各组1×107个细胞，PBS冲洗3次，随后加入细胞裂解液处理细胞，并使用超声仪处理辅助破碎细胞，离心去除细胞碎片后收集上清，提取总蛋白，在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移4 h到PVDF膜上，然后37 ℃封闭2 h后加入ABCE1一抗，与膜孵育1 h，然后洗膜，加入辣根酶标记二抗，37 ℃孵育2 h，PBB洗涤，最后ECL试剂盒进行化学发光检测，压片、显影、定影，采用Image-Pro Plus7.0软件分析条带灰度值。每个实验重复3次，取平均值。

1.4 细胞迁移能力观察 将“1.2中”miR-299-3p组和对照组A549细胞接种于6孔板，细胞生长至汇合后，使用200 μL移液枪头对细胞层进行划痕，并标记划痕位点，显微镜下进行拍照；2 d后，显微镜下对同一划痕微点再次进行拍照观察，评价肿瘤细胞向划痕区的迁移情况。

1.5 细胞增殖能力及多柔比星敏感性观察 取“1.2中”miR-299-3p组和对照组A549细胞，以5×103每孔接种于96孔培养版，每孔100 μL培养基，每天进行1次CCK-8检测，共检测6 d，基本方法是向每孔细胞中加入10 μL CCK-8试剂，继续在孵箱中孵育1.5 h，随后在450 nm波长处使用酶标仪检测OD值。此外取“1.2中”miR-299-3p组和对照组A549细胞，经不同浓度(0、0.1、1、10、50 μg/mL)多柔比星处理，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性(OD值)。

1.6 各组细胞Csp3、p-Akt蛋白检测 取A549细胞，随机分为4组，miR-299-3p转染组以miR-299-3p转染A549细胞，多柔比星组加入50 μg/mL单纯多柔比星，联合组以miR-299-3p转染A549细胞并加入50 μg/mL多柔比星，对照组细胞不做任何处理。胰酶消化收集各组细胞1×107个细胞，PBS冲洗3次，随后加入细胞裂解液处理，并使用超声仪处理辅助破碎细胞，离心去除细胞碎片后收集上清，通过BCA法测定蛋白浓度。通过凝胶电泳对蛋白进行检测，每个泳道上样量为80 μg；电泳结束后以100 V恒压电转4 h，将蛋白转移PVDF膜，37 ℃封闭2 h，后加入p-Akt抗体、Akt抗体、Caspase3抗体一抗，与膜孵育1 h，然后洗膜，加入辣根酶标记二抗，37 ℃孵育2 h，PBB洗涤，最后化学发光显色试剂盒进行检测，压片、显影、定影，以GAPDH蛋白条带标准化目的蛋白条带，目标蛋白条带的定量是使用Image-Pro Plus7.0分析软件对条带的灰度值进行测定，实验重复3次，取平均值。

1.7 各组细胞凋亡能力观察 通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测细胞凋亡，操作步骤按照厂家说明书进行。染色后的细胞通过4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记细胞核，在荧光显微镜下观察TUNEL标记的阳性细胞比例，并计数，细胞凋亡比例=TUNEL阳性细胞数/DAPI染色细胞数。

2 结果

2.1 各组ABCE1蛋白表达比较 miR-299-3p组、随机miRNA组、对照组ABCE1蛋白相对表达量分别为0.46±0.11、1.17±0.20、1.04±0.17，miR-299-3p组分别与随机miRNA组、对照组比较，P均<0.05。

2.2 各组细胞迁移能力比较 实验2 d后，miR-299-3p组、对照组细胞划痕区域宽度分别为415.34±57.42、422.45±60.31，两组细胞划痕区域宽度未观察到明显差异(详见图1)。

图1 两组细胞划痕区域宽度比较

2.3 两组各时点细胞增殖能力比较 结果见表1。由表1可知，两组各时点细胞OD值比较均无统计学差异(P均>0.05)。

表1 两组各时点细胞增殖能力比较

2.4 两组细胞多柔比星敏感性比较 结果见表2。

2.5 各组细胞Csp3、p-Akt蛋白表达比较 结果见表3。

表2 两组细胞多柔比星敏感性比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表3 各组细胞Csp3、p-Akt蛋白表达比较

注：与miR-299-3p组比较，*P<0.05；与多柔比星组比较，ΔP<0.05。

2.6 各组细胞凋亡能力比较 联合组、多柔比星组、miR-299-3p组、对照组凋亡细胞数分别为33.76%±5.73%、17.35%±5.21%、4.33%±1.93%、3.10%±2.12%，联合组、多柔比星组分别与miR-299-3p组、对照组比较，P均<0.05。

3 讨论

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全世界癌症死亡的主要原因，每年导致超过100万人死亡[13]。根据临床病理特征，主要肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)两种组织学亚型。SCLC对放疗和化疗均具有高度敏感的反应，但是耐药性导致高复发率和不良预后。一般来说，SCLC患者最终确诊后2年生存率低于5%[14]。多柔比星是一种蒽环类药物，广泛用于化疗方案治疗SCLC患者。但目前化学耐药已成为SCLC治疗的主要障碍之一，是改善SCLC临床预后不良的重要问题。为了提高化疗效果，增加给药剂量是最直接的治疗方式，但这一策略在提高化疗效果的同时，也增加了对正常机体细胞的负效应，可行性受到很大限制。因此，在不改变药物剂量的条件下，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，对于改善化疗效果具有重要意义。A549细胞最早是在1972年由Giard等通过一个白人成年男性的外植体肿瘤，转移并培养肺肿瘤组织而得到的。由于A549细胞体外培养会成长为单层细胞，附着或紧贴在培养瓶上，也可以固定或悬挂在体外的溶液中。因此，研究者多采用A549细胞作为研究对象。

研究发现，一些miR的表达与疾病发生发展密切相关，其中肿瘤相关疾病是其研究最热的领域之一，涉及肿瘤增殖、迁移、凋亡、药物耐受等多个领域。一般而言，一个miR分子可能存在多个靶基因，一个基因也可能同时受到多个miR分子的调控[15]。以往报道证实，ABCE1是肺癌耐药相关基因，靶向抑制ABCE1的miR-299-3p能够显著提高肺癌细胞A549对多柔比星的敏感性，有望发展成为协同多柔比星抑制肺癌以及克服药物耐受肺癌的联合基因疗法[16]。ABCE1是以往已被证实的一个肺癌相关耐药基因，也是miR-299-3p的靶基因之一。本研究也进一步证实了miR-299-3p对ABCE1基因具有靶向抑制作用。尽管miR-299-3p已被鉴定出来，但其生物学功能仍然知之甚少。研究[17]发现，miR-299-3p在白血病中显著下调。之前的研究[18]表明，miR-299-3p在骨肉瘤组织中表达下调，并证明其与化疗有关。最近一项研究[19]报道，miR-299-3p的失调与肺癌中的阿霉素耐药有关。然而，miR-299-3p在肺癌阿霉素耐药中的确切作用尚不清楚。研究发现，阿霉素耐药肺癌组织中miR-299-3p表达下降幅度大于阿霉素敏感性肺癌组织。文献报道，miR-299-3p在H69/ADR细胞中显著降低，miR-299-3p的过表达显著抑制H69/ADR肺癌细胞增殖，增加细胞凋亡。miR-299-3p在H69/ADR肺癌细胞增殖和细胞凋亡中起关键作用[15]。本研究通过划痕实验证实，miR-299-3p转染的A549细胞并不影响其迁移能力。细胞增殖活性检测发现，miR-299-3p对靶基因ABCE1的抑制作用并不影响A549细胞的增殖能力。进一步了解miR-299-3p转染是否影响了A549细胞对多柔比星的敏感性，结果表明miR-299-3p转染显著增加了A549细胞对多柔比星的敏感性。Csp-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，Csp-3通过调控细胞内某种酶可裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡。Akt又称为蛋白激酶B，是细胞内信号转导通路上的一种原癌基因，磷脂酰肌醇3-激酶使Akt活化后生成p-Akt，可直接或间接调控细胞凋亡，发挥促进肿瘤细胞生存作用。本研究表明，miR-299-3p联合多柔比星处理的A549细胞中Csp3水平显著较高，p-Akt水平显著降低，其凋亡细胞显著增多，显著的优于单独多柔比星组和miR-299-3p组。说明miR-299-3p联合多柔比星可显著促进肿瘤细胞的凋亡。

总之，miR-299-3p靶向抑制耐药基因ABCE1的表达，其过表达并不能显著抑制A549细胞的增殖，但miR-299-3p联合多柔比星可促进了肺癌A549细胞对多柔比星的敏感性，显著促进了A439细胞的凋亡，有望作为一种协同化疗的核酸药物。