揿针对肿瘤抑郁模型小鼠血清学及海马结构的影响＊

廖 娟，韩布新，李 静，赵 楠

（中国中医科学院西苑医院肿瘤科 北京 100091）

肿瘤作为一种应激，必然会使患者产生紧张、焦虑、抑郁等情绪反应，而这种长期、慢性的应激，则引起下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）功能亢进，导致海马结构形态与功能的损伤[1,2]。揿针作为微型针灸针，于传统针灸针相比，最大的优点在于延长了针刺效应的时间[3]，揿针已广泛应用于对肿瘤相关抑郁状态的临床干预，但缺乏客观临床疗效数据和基础实验室相关数据支持，本实验观察揿针对肿瘤抑郁模型小鼠血清五羟色胺（5-HT）和肾上腺素（EBI）水平及脑组织海马中CA1 区细胞层数目及结构改变，探讨揿针抗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

用雄性昆明小鼠50 只，8-12 周龄，体重18-20 g，由中国中医科学院西苑医院动物实验中心提供，合格证：SCXK（沪）2007-0005。小鼠饲养环境温度为24℃，湿度为40%-50%，在西苑医院动物房大鼠适应性喂养3 d后，观察无异常纳入实验。

1.1.2 HE实验仪器

实验器材：Tissue-TEK VIP6 生物组织脱水机（日本樱花公司）；Tissue-TEK TEC 生物组织包埋机（日本樱花公司）；Leica RM2235 组织切片机（德国莱卡公司）；Leica CV5030 自动封片仪（德国莱卡公司）；Olympus BX53 显微镜（美国奥林帕斯公司）；Path QC病理质控和资料管理系统（中国朗珈公司）。

1.1.3 主要试剂和针具

小鼠5 羟色胺ELISA 试剂盒、小鼠肾上腺素（EPI）ELISA试剂盒，北京派拓科技有限公司生产；针具为华佗牌一次性揿针（0.22 × 2.0 mm），苏州医疗用品有限公司；华成牌一次性无菌针灸针，0.25 × 25 mm（生产许可证号：京食药监械生产许20110003号）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及干预

选取健康雄性昆明小鼠45 只小鼠均在其腹腔内注射S180 瘤株，制备肿瘤模型。肿瘤造模成功后，肿瘤小鼠均进行为期14 d 的慢性不可预知温和刺激（CUMS）抑郁造模，造模成功后，按随机数字表法分为揿针组、传统针灸组，肿瘤抑郁造模组，以5 只健康雄性昆明小鼠作为正常对照，集体饲养。揿针组、传统针灸组均针刺“百会”、“印堂”干预14 d。2 周后观察小鼠海马结构改变，酶联免疫吸附（ELISA）法测定小鼠血清五羟色胺（5-HT）和肾上腺素（EBI）水平。每笼5 只，其余各组小鼠单笼饲养。自然对照组及肿瘤抑郁模型组不作处理。揿针组选取小鼠百会、印堂穴为治疗穴位，埋针48 h，每周3 次。传统针灸组选取小鼠百会、印堂穴每2 d 1次，每次留针20 min。干预2周。

1.2.2 旷场试验

将大鼠置于实验箱的箱底中央格,敞箱顶部摄像头记录其5 min 内的活动并通过连接电脑储存分析数据。每只大鼠测试结束后，立即清理箱内的粪便及尿液，同时使用75%酒精喷洒擦拭实验箱，避免前只大鼠所遗留气味对下只大鼠行为检测造成影响。

1.2.3 电镜

取新鲜海马组织1 mm3，经Leica RM2235 组织切片机（德国莱卡公司）修块，Leica ST5020（德国莱卡公司）自动染色机染色，再经Leica CV5030 自动封片仪（德国莱卡公司）封片固定；Olympus BX53 显微镜（美国奥林帕斯公司）；Path QC 病理质控和资料管理系统（中国朗珈公司）。

1.3 小鼠造模建立

基于文献[4]，关于接种S180腹腔肉瘤瘤株后，瘤体在小鼠体内生存期为5 周的研究结论，本课题组讨论决定修改整个实验实施方案：肿瘤造模1周、抑郁造模2周、揿针干预2周，共5周的小鼠动物实验。

1.3.1 小鼠肿瘤造模建立

健康雄性昆明小鼠50 只，除自然对照组（Group A）5 只小鼠一起饲养在同一个笼子中，其余45 只小鼠先进行肿瘤造模：S180 腹腔肉瘤瘤株（北京大学动物实验中心培养）注射到小鼠腹腔，1周后观察其小鼠腹腔肿瘤瘤体是否接种成功，周期为1周。

S180 肿瘤模型的建立：复苏S180 细胞，腹腔注射KM 雌性两只，进行细胞培养，取S180 肉瘤7 d 生长良好的腹水型小鼠，在无菌操作下抽取腹水，用灭菌的生理盐水稀释，调节细胞数为6 个·mL-1，置于冰水中保存备用；将50 只昆明小鼠机取出5 只作为空白对照组，其余45 只，每只左前肢腋窝皮下接种S180 瘤细胞悬液0.2 mL；接种1周后观察成瘤情况。

1.3.2 小鼠抑郁模型的建立

参考Willner的研究[5]并改进。采用慢性不可预知温和刺激造模。在抑郁造模开始前，实施预实验中发现：肿瘤接种成功小鼠不能承受Willner的研究中慢性不可预知温和刺激造模步骤，分析其原因，可能与肿瘤小鼠体内瘤负荷不断加大，自身免疫力降低因素相关，故减少对肿瘤小鼠抑郁刺激造模到刺激强度和时间，共接受14 d7 种不同应激，包括热水游泳（38℃，3 min）、冷刺激（4℃，3 min）、禁食24 h、禁水24 h、昼夜颠倒、潮湿鼠笼24 h、夹尾悬尾（1 min），每天随机安排1 种，使小鼠不能预料刺激到发生，刺激周期为2周。

1.4 实验方法

1.4.1 分组

采用随机数字表法将昆明小鼠分为揿针组、传统针灸组、肿瘤造模对照组，各组各8 只。自然对照组（Group A）：在相同条件下，5 只健康昆明小鼠正常饲养，一起饲养在同一笼中，不作任何造模和干预处置，观察周期2周。

1.4.2 肿瘤抑郁模-揿针组（Group B）

8只肿瘤小鼠接受揿针干预，采用直径为0.22 mm，长度为2.5 mm 的揿针，即：将0.2 mm×1.5 mm 揿针埋入CUMS 大鼠，埋针24 h 后取出，每周2 次，周末不埋针，连续2周。

1.4.3 肿瘤抑郁模-传统针灸组（Group C）

8 只肿瘤小鼠接受传统针灸干预，采用直径为0.22 mm，长度为25 mm 的传统针灸，取百会、大椎，本研究大鼠干预的穴位参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴谱》选取穴位[9]。选用0.25 mm×15 mm 毫针，百会穴向前平刺2 mm，大椎直刺2 mm，平补平泻法，固定小鼠留针20 min，每周2次，周末不埋针，连续2周。

1.4.4 肿瘤抑郁模型组（Group D）

8只肿瘤小鼠不接受任何干预，连续2周。

图1 小鼠血清内5-HT、EPI含量（ng·mL-1）

1.5 指标观察

1.5.1 血清5羟色胺（5-HT）及肾上腺素（EPI）的测定

各组动物于第14 d 末次治疗的24 h 后，快速断头取血，血液在冰浴试管中静止30 min。4℃，3000 r·min-1离心10 min，分离血清，保存在-80℃的冰箱中，以备待测。用ELISA 免疫分析法测定血清皮质醇和血清5羟色胺（5-HT）及肾上腺素（EPI）的含量，按试剂盒说明书进行操作，弃去液体，重复洗涤5次。

1.5.2 海马组织CAl区的细胞层数变化

肿瘤抑郁造模14 d，各组不同干预2 周后，每组取7 只小鼠，用颈椎脱臼法处死后立即解剖，取海马，下丘脑组织标本，固定于4%多聚甲醛中。24 h 后乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，4 um 切片，进行HE 染色和免疫组化，光镜下观察阳性细胞表达情况。

1.6 统计学处理

统计学处理全部数据用SPSS13.0 软件统计包处理，以平均值加减标准差（±s）表示，组间差异采用方差分析（ANOVA），以P＜0.01为显著性差异的标准。

2 结果

2.1 各组小鼠ELISA法测5-HT及EPI含量（ng·mL-1）

在应激后第14 d 处死小鼠，快速冰冻取脑，采用ELISA 方法测定5-HT 及EPI 含量。传统针灸组小鼠血清5 羟色胺（5-HT）及肾上腺素（EPI）含量较其他3组均显著降低，有统计学差异（P＜0.05）；揿针组与肿瘤抑郁模型组和自然饲养组血清5 羟色胺（5-HT）及肾上腺素（EPI）含量比较，均有明显降低趋势，无统计学差异（P＞0.05）；可见通过针刺干预后，抑郁模型小鼠血清5 羟色胺（5-HT）及肾上腺素（EPI）含量均能显著下降，从而通过抑郁亢进的HPA 轴发挥治疗肿瘤相关性抑郁到作用（图1）。

图2 自然饲养组（D组）

图3 肿瘤抑郁模型组（C组）

图4 揿针组（A组）小鼠

2.2 海马组织CAl区的细胞层数变化

自然饲养组（图2）显示小鼠海马CA1 区细胞层数；肿瘤抑郁模型组（图3）小鼠海马CA1 区细胞层数3-4 层，锥体细胞排列稀疏，细胞间隙增大，细胞固缩变性。揿针组（图4）和传统针灸组（图5）海马CA1 区神经元层次增加，排列清晰，固缩和空泡化的核减少，细胞脱落少见。

图5 传统针灸组（B组）

3 讨论

3.1 肿瘤相关抑郁状态的中医认识

肿瘤相关抑郁状态（Cancer related depression,CRD）是以肿瘤为基础疾病而引发的一组症状或状态，对肿瘤患者的生存质量产生直接影响[6]；我国肿瘤相关性抑郁在肿瘤疾病中发病率约为25.8-58.0%，要显著高于正常人群抑郁症的发病率（18.37%）[7-9]。抑郁发病根源源于脑神紊乱[10]，当气机失调时，脑神紊乱而使五脏功能失调，郁证发生。脑为元神之府，督脉入络脑，神庭、百会穴位于督脉上，是临床治疗抑郁症的常用腧穴，有调理脑神之功效,针刺刺激腧穴可增强经络的经气传导，调节免疫、内分泌及神经系统，达到安神解郁目的[11]，所以治郁必先治脑，脑气通调，则郁自解，神自宁。

3.2 针刺穴位及疗效

针刺作为应激刺激的一种,和其他应激刺激都能促进下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的功能，促进AcTH的分泌，增加肾上腺皮质重量[12]。既往研究显示，中医针刺在治疗抑郁症方面具有较好的有效性、安全性和患者可接受性，但其抗抑郁的效应机制仍未明晰[13-16]。百会属督脉，督脉是诸阳经之汇，对整个经脉系统有统帅作用，其主干行于脊里，上行至风府进入脑内，上循颠顶，故督脉与脑、脊髓有密切关系，历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说[17]，印堂为经外奇穴，督脉经气流注之所，具有醒脑安神作用。前期临床研究证实[18-19]，电针百会、印堂可以缓解抑郁症情绪低落的主症，还可整体调节机体，疗效与药物百忧解相当。

实验研究[20,21]亦表明，电针百会、印堂可改善不同抑郁模型大鼠抑郁样行为，故本研究采用百会、印堂穴进行干预。既往研究显示针刺治疗抑郁症有效率83%[22]，其中采用“通督调神针法”的总有效率达96.7%，这些都为针灸治疗抑郁提供新道思路和方向[23]。针灸治疗抑郁症的机理逐年增多，督脉为诸阳之汇，统督全身阳气，养脑安神，是临床上治疗抑郁症最常见的穴位[24,25]，针刺能够兴奋大脑皮层，促进抗抑郁物质释放，修复受损神经功能，改善患者的抑郁症状[24,26]。本次研究，揿针百会增加抑郁小鼠行为学改善，提高其血清5-HT 含量，有效调节肿瘤抑郁小鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA 轴）功能，与既往同类研究一致。

3.3 肾上腺素和5-羟色胺类与抑郁的关系

本研究自然饲养组的5-HT 含量的平均值为1.773 ng·mL-1，肿瘤抑郁造模后，造模组5-HT 含量的平均值降至1.498 ng·mL-1，提示抑郁导致5-HT含量的降低，与既往研究一致[27]。经过针刺干预后，针灸组5-HT 含量的平均值0.364 ng·mL-1，揿针组的5-HT 含量平均值为0.519 ng·mL-1，均比造模组提高，提示针刺能够提高抑郁5-HT 含量，表明针刺能够改善抑郁状态。针灸组能够很好的改善肿瘤相关性抑郁。从图1 显示，自然饲养组的5-HT 含量的平均值为1.773 ng·mL-1，肿瘤抑郁造模后，造模组5-HT 含量的平均值降至1.498 ng·mL-1，提示抑郁导致5-HT 含量的降低，与既往研究一致[27]。经过针刺干预后，从图显示，针灸组5-HT 含量的平均值0.364 ng·mL-1，揿针组的5-HT 含量平均值为0.519 ng·mL-1，均比造模组提高，提示针刺能够提高抑郁5-HT 含量，表明针刺能够改善抑郁状态。针灸组能够很好的改善肿瘤相关性抑郁（图1）。同理，自然饲养组的EBI 含量的平均值为0.127 ng·mL-1，肿瘤抑郁造模后，EBI 含量的平均值升高到0.174 ng·mL-1，提示抑郁导致EBI 含量升高，经过针刺干预后，针灸组的EBI含量的平均值为0.146 ng·mL-1，揿针组的的EBI 含量的平均值为0.150 ng·mL-1，均比造模组降低，提升针刺能够改善抑郁状态（图2）。

3.4 海马组织CAl区的细胞层数变化

本研究通过观察肿瘤抑郁造模小鼠针刺干预后海马CA1 区细胞层数的改变，发现在肿瘤抑郁模型组小鼠海马CA1区细胞层数3-4层，锥体细胞排列稀疏，细胞间隙增大，细胞固缩变性（图3）。揿针组（图4）和传统针灸组（图5）海马CA1 区神经元层次增加，排列清晰，固缩和空泡化的核减少，细胞脱落少见。从上述光镜下各组海马CAl 区的细胞层数变化，可知肿瘤相关性抑郁能导致小鼠海马CAl 区的细胞层数减少，细胞固缩变性，导致海马体积缩小，与既往抑郁相关研究结果一致。经过针刺干预后，小鼠海马CA1 区神经元层次增加，排列清晰，固缩和空泡化的核减少，细胞脱落少见，证实针刺能够有效恢复小鼠海马CAl 区的细胞层数，改善抑郁海马结构，进一步改善肿瘤相关性抑郁。既往研究显示，海马体积减小与海马神经元数目减少、顶树突萎缩、线粒体嵴破坏、突触小泡数量减少等有直接联系[17]。

本次研究结果显示，自然对照组海马结构完好，而肿瘤抑郁模型组海马结构病理改变明显，表现为小鼠海马CAl区的细胞层数减少，细胞固缩变性，导致海马体积缩小，与既往抑郁相关研究结果一致。经过针刺干预后，小鼠海马CA1 区神经元层次增加，排列清晰，固缩和空泡化的核减少，细胞脱落少见，证实针刺能够有效恢复小鼠海马CAl 区的细胞层数，改善抑郁海马结构，进一步改善肿瘤相关性抑郁。本次研究结果提示，揿针可以修复肿瘤抑郁小鼠海马结构到破坏。既往研究显示，5-羟色胺受体在抑郁症患者脑中所含的数目要比普通人脑中所含的数目低[27]。

海马内5-HT 含量改变是抑郁症的敏感指标（杨亦龙等，2015）。5-HT 含量减低出现抑郁症状，增加海马5-HT 含量治疗，可使抑郁症状早期得到明显改善[28]。

综上，揿针对肿瘤相关性抑郁小鼠具有抗抑郁作用，该作用可能通过提高小鼠血清中的5 羟色胺含量和降低肾上腺素含量而实现，从而调节下丘脑-垂体-肾上腺素轴功能状态，改善小鼠脑组织海马CA1区神经元层次增加，改善海马体积实现到。