二元表法和MCID法快速鉴定烟草品种

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(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001; 2.河南省中烟工业有限责任公司技术中心，河南 郑州 450000)

烟草加工过程中根据不同卷烟配方要求将不同品种叶丝进行参配，经后续加工处理，最终加工成不同风格和品质的卷烟[1-4]。在卷烟生产加工过程中，由于不同品种烟叶在收购价格上存在差异，鱼目混珠现象时有发生，最终造成卷烟配方失真、卷烟品质出现波动。烟草品种鉴定常通过分级人员眼观手摸从形态上对烟草品种进行判断，该鉴定方法虽简单经济，但准确性有待商榷[5]。近年来，随着分子生物学发展，品种鉴定方法由宏观向微观进行变化，多种分子标记方法已用于烟草品种的鉴定研究。其中，RAPD标记技术于1990年首次提出，因具有操作简单、费用低、速度快、灵敏度高等优点[6]，在烟草的品种鉴定、亲缘关系分析、抗性鉴定等方面广泛应用[7-11]。王志德等[7]利用43个RAPD随机引物对24个烟草核心种质进行分析，建立了相关的指纹图谱，并利用聚类分析方法成功对其进行遗传关系分析。杨友才等[8]利用RAPD方法筛选出28个随机引物，对48个烟草品种进行多态性分析，并利用聚类分析法对样品的遗传关系进行分析。马林等[9]成功将RAPD标记转化为SCAR标记，建立了12个烟草品种的鉴别路线。王贵[10]利用RAPD和SCAR标记技术成功筛选出2个与马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)抗性相关的分子标记。苏凯等[11]利用RAPD分子标记技术对贵州38个烟草黑胫病菌株进行遗传多样性分析，探索不同种植区病菌的遗传分化关系。

目前，RAPD指纹图谱分析方法包括聚类分析法、电泳谱带数据库法、二元表法和人工绘制品种树图(MCID)法等[12]。聚类分析法虽是较常用的分析方法，但仅表示出品种间的遗传关系，在实际鉴定过程中直观性较差，实践性较弱；电泳谱带数据库法由于凝胶成像过程中所调参数不同，实际电泳图谱与电泳数据库中保存电泳图谱的一致性存在差异，因此实践性也较低；二元表法构建指纹图谱是目前最为常用的分子鉴定方法，在烟草鉴定中已得到广泛应用[13-14]；MCID法是一种新的指纹图谱分析方法，在林木、蔬菜、水果品种鉴别中应用较为广泛[15-21]。许园园等[18]利用筛选出的4个RAPD引物，成功绘制出20个萝卜品种的MCID。王玉娟等[19]筛选出6条RAPD引物，利用MCID法对72个葡萄品种进行鉴别。ZHAO等[20]利用筛选出的RAPD引物，绘制出46个草莓品种的MCID，成功对46个草莓品种进行鉴别。以往烟草品种鉴定研究多使用二元表法，MCID法在烟草鉴定领域鲜有报道。因此，本研究利用RAPD分子标记构建13个烟草品种的DNA指纹图谱，分别采用二元表法和MCID法对DNA指纹图谱进行分析，通过对比2种分析方法的优劣，建立一套合理的烟草品种鉴定方法。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂、仪器

1.1.1 材料 13个烟草品种来自郑州轻工业学院烟草生物技术研究室，具体见表1。烟苗长至五叶一心时采集烟叶样品，并于液氮速冻后放至-80 ℃超低温冰箱保存。

表1 供试13个烟草品种的名称及其编号 Tab.1 The names and numbers of 13 tobacco varieties used in this study

1.1.2 试剂 磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒购自洛阳惠尔纳米科技有限公司；2×TaqPlus Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RAPD引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.3 仪器 全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司)、NanoDrop ND-2000C超微量分光光度计(赛默飞世尔科技公司)、DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、Vetiti型梯度PCR仪(美国ABI公司)、Mini Bis Pro型凝胶成像分析系统(以色列DNR凝胶成像系统有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取幼嫩叶片约0.2 g，用快速研磨仪将样品磨碎。利用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒提取烟草基因组DNA，操作过程及试剂用量均以试剂说明书为准。用1.5%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测DNA的质量和浓度，将DNA稀释至50 ng/μL置于-20 ℃保存。

1.2.2 特异性引物筛选 利用实验室建立的RAPD-PCR反应体系和程序对合成的150条随机引物进行特异性筛选，并对特异性较好的随机引物进行退火温度优化，筛选出重复性好、特异性高、条带清晰稳定的随机引物，用于烟草品种鉴定。

1.2.3 RAPD-PCR扩增反应 RAPD-PCR反应体系：50 ng/μL模板DNA 1 μL，2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物1 μL，ddH2O补至25 μL。RAPD-PCR反应程序：94 ℃预变性6 min；94 ℃变性50 s，退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸6 min。

1.2.4 扩增产物凝胶电泳分析 PCR扩增产物在85 V条件下于1.5%琼脂糖凝胶中电泳40 min，利用凝胶成像系统观察拍照。

1.2.5 二元表法分析DNA指纹图谱 根据特异性随机引物凝胶成像结果，当某烟草品种在特异性位点有特异性条带时，记录为“1”，当某品种在特异性位点无特异性条带时，记录为“0”，最终由“0”“1”形成每个品种特定的分子ID。

1.2.6 MCID法分析DNA指纹图谱 根据特异性随机引物凝胶成像结果，在某一随机引物的参与下，将能扩增出相同特异性条带的品种归为同一组，如果有品种扩增出自身独有的特异性条带，则该品种被鉴定出来；之后在小组内逐一用其他特异性引物进行鉴别，直至所有的品种被鉴定出。最后人工绘制植物品种鉴别简图，并在图中注明引物编号和特异性条带的位点。

2 结果与分析

2.1 烟草DNA的提取

利用磁珠法提取13个烟草品种DNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1 所示。从图1可以看出，提取的烟草基因组DNA条带清晰，无明显杂带和拖尾出现，可用于后续试验。

1—13:材料编号，下同1—13:Numbers of tobacco varieties.The same below图1 13个烟草品种基因组DNA的凝胶电泳结果Fig.1 Genomic DNA electrophoresis patterns of 13 tobacco varieties

2.2 引物筛选及退火温度优化

从合成的150条随机引物中共筛选出28条能产生特异性条带的随机引物，并对其退火温度进行优化，其中，S29、S42、S301、L189等4条随机引物的特异性较高，能产生稳定且清晰的特异性条带，具体见表2。

表2 RAPD引物及退火温度Tab.2 RAPD primers and their annealing temperature

2.3 RAPD-PCR产物凝胶电泳结果

利用筛选出的特异性较强的引物S29、S42、S301、L189对13个烟草品种进行RAPD-PCR扩增，所得产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳40 min，利用凝胶成像系统观察拍照，有稳定清晰的特异性条带出现(图2—5)。

M：DNA marker DL2000，下同 M：DNA marker DL2000.The same below图2 引物S29扩增的13个烟草品种指纹图谱 Fig.2 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer S29

图3 引物S42扩增的13个烟草品种指纹图谱 Fig.3 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer S42

图4 引物S301扩增的13个烟草品种指纹图谱 Fig.4 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer S301

图5 引物L189扩增的13个烟草品种指纹图谱 Fig.5 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer L189

2.4 构建二元表快速鉴定烟草品种

据图2可知，引物S29在620、950、1 000、1 200 bp处能扩增出4条特异性条带。在620 bp处，5号、11号和12号品种特异性条带缺失，记为“0”，其余品种记为“1”；在950 bp处，仅7号品种出现特异性条带，记为“1”，其余品种记为“0”，7号品种被鉴定出来；在1 000 bp处，1号、2号、4号、6号、10号、13号有特异性条带出现，记为“1”，其余品种记为“0”；在1 200 bp处，仅13号品种扩增出特异性条带，记为“1”，其余品种记为“0”，13号品种被鉴定出来。

由图3可知，引物S42在980、2 000、2 500 bp处能产生有效的特异性扩增。在980 bp处，1号、4号、8号品种特异性条带缺失，则记为“0”，其余品种记为“1”，8号品种被鉴定出来；在2 000 bp处，5号、9号、12号品种有特异性条带出现，记为“1”，其余品种记为“0”，3号、9号、10号品种被鉴定出来；在2 500 bp处，5号、6号、9号、11号、12号、13号有特异性条带出现，记为“1”，其余品种记为“0”，6号品种被鉴定出来。

由图4可知，引物S301在750 bp和2 050 bp处能产生有效的特异性扩增。在750 bp处，6号、9号、10号品种能产生特异性条带，记为“1”，其余品种记为“0”，2号和10号品种被鉴定出来；在2 050 bp处，1号、6号、8号、9号品种能产生特异性条带，则记为“1”，其余品种记为“0”，1号和4号品种被鉴定出来。

由图5可知，引物L189在750 bp处能产生有效的特异性条带，5号、6号、7号、8号、11号品种该特异性条带消失，记为“0”，其余品种记为“1”，5号和12号品种被鉴定出来。

最终构建的由“0”“1”组成的二元分子ID表如表3所示。

表3 供试13个烟草品种的分子ID Tab.3 Molecular ID of 13 tobacco varieties

2.5 利用MCID法快速鉴定烟草品种

由引物S29对13个烟草品种扩增的DNA指纹图谱(图2)可知，根据620、950、1 000、1 200 bp处4条特异性条带的有无可将13个烟草品种分为5组，出现特异性条带时用(+)表示，缺失特异性条带时用(-)表示。第1组为620 bp(+)、950 bp(-)、1 000 bp(+)和1 200 bp(-)，包含1号、2号、4号、6号和10号5个品种；第2组为620 bp(+)、950 bp(-)、1 000 bp(-)和1 200 bp(-)，包含3号、8号、9号3个品种；第3组为620 bp(-)、950 bp(-)、1 000 bp(-)和1 200 bp(-)，包含5号、11号、12号3个品种；第4组为620 bp(+)、950 bp(+)、1 000 bp(-)和1 200 bp(-)，仅包括7号品种，因而7号品种(延晒7号)被单独鉴定出来；第5组为：620 bp(+)、950 bp(-)、1 000 bp(+)和1 200 bp(+)，仅包括13号品种，因此13号品种(GR17)被鉴定出来。

针对第1组5个品种来说，由引物S42扩增的DNA指纹图谱(图3)可知，根据980、2 000、2 500 bp处3条特异性条带的有无可以将第1组的5个烟草品种分为3组，第1亚组为：980 bp(-)、2 000 bp(-)和2 500 bp(-)，包含1号和4号2个品种；第2亚组为：980 bp(+)、2 000 bp(-)和2 500 bp(-)，包含2号和10号2个品种；第3亚组为：980 bp(+)、2 000 bp(-)和2 500 bp(+)，仅有6号品种，因此6号品种(云烟202)被鉴定出来。再用引物S301对第1、2亚组进行区分，第1亚组中4号品种在750 bp和2 050 bp处均无特异性扩增，而1号品种在2 050 bp处有特异性扩增，则1号和4号品种被分别鉴定出来；第2亚组中，在750 bp处2号品种无特异性扩增，10号品种有特异性扩增，2号和10号品种被鉴定出来。另外2组按照类似的鉴定方法进行鉴定，直至将组内所有的品种鉴别开。最后，结合所用引物及扩增的特异性条带信息绘制所有烟草品种的鉴定简图，即人工绘制的烟草品种鉴别简图(图6)。

(+)表示有特异性条带；(-)表示缺失特异性条带 (+) represents specific band; (-) represents no specific band图6 4个随机RAPD引物鉴别区分13个烟草品种的MCID Fig.6 MCID of the 13 tobacco varieties identified by 4 random RAPD primers

3 结论与讨论

利用二元表建立品种分子ID对烟草品种进行鉴定，在分析电泳结果时，用“1”“0”表征特征条带的“有”“无”，形成不同的排列组合，构成不同品种的分子ID。但随着待测品种数量的不断增加，“1”“0”矩阵复杂程度增加，对比鉴别工作量增大，直观可读性大大降低。利用MCID法鉴定烟草品种，在分析电泳结果时，不同品种根据某引物扩增出的特异性条带有无的组合情况被分到不同的小组中，之后又将每一小组作为新的研究对象进行鉴别分组，直至所有的品种被鉴定出。由于MCID法不断把有相同特征谱带的品种划为1个小组，不断缩小研究范围，具有较强的操作性，克服了二元表法在鉴定分析大量品种时的不足，可用于大量品种的鉴定分析；同时，MCID法具有较强的融入功能，新品种加入后，当树图上已有的特异性引物能将其与图中已有品种区分开时，只需将其指纹信息加入到树图中，当原有引物无法满足需要时，则需要筛选新的特异性引物进行特异性区分，工作量不大。因此，当鉴定品种较少时，二元表法和MCID法2种方法都可方便地鉴定不同品种；但当鉴别品种较多时，MCID法更加直观，可操作性也更强，这与许圆圆等[18]的观点相一致。

本试验为克服RAPD分子标记技术稳定性差的缺点，经过3次重复试验，筛选出28条重复性好、多态性高的随机引物，又通过退火温度优化从中筛选出4条稳定性好的RAPD引物作为标记引物，成功对13个烟草品种进行特异性分子标记。结果显示，二元表法和MCID法都能直观地呈现出13个烟草品种的鉴定结果。当供试品种较多时，MCID法由于可添加性和直观性较好，更具实际操作价值，可在烟草行业中用于大量烟草品种的快速鉴定。