宫颈癌组织中miR-216b 与FOXM1 表达及与临床病理特征的关系

王梦漪 卢宏达 陈 莉 雷 章

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院肿瘤科，湖北武汉 430014

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，在所有女性恶性肿瘤中排第三位，死亡率较高，严重危害女性健康［1］。手术治疗和局部放疗是目前主要治疗方案，但晚期患者治疗效果不佳，5 年生存率较低［2］。因而，有必要进一步研究其发生发展的分子机制。微小RNA（miR）是长度为18～25 个核苷酸的内源性非编码RNA 调控因子，参与细胞分化、细胞周期凋亡调控和细胞迁移等［3］。宫颈癌中存在多种miR 的异常表达现象，且miR 可通过调节下游靶基因的表达，参与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学过程［4-5］。有研究报道显示［6］，长链非编码RNAXLOC_008466 可作为分子海绵结合miR-216b，调控癌细胞的增殖及迁移。然而miR-216b 在宫颈癌中的表达及相关机制研究鲜有报道。叉头框蛋白M1（FOXM1）参与细胞的有丝分裂过程，该蛋白异常表达可导致因纺锤体缺陷引起的有丝分裂过程的延迟，进而影响癌细胞的增殖［7］。本研究中，通过检测宫颈癌组织中miR-216b 及FOXM1 表达情况，分析两者之间的相关性，初步探讨其作用机制及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年3 月～2019 年3 月华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院（以下简称“我院”）诊治的宫颈癌患者84 例作为病例组，同期选取我院诊治的宫颈上皮内瘤变（CIN）患者40 例作为CIN 组，经病理确诊为子宫肌瘤患者40 例作为对照组。病例组年龄34～65 岁，平均（55.7±5.4）岁；病理类型：宫颈鳞癌63 例，子宫腺癌21 例；分化程度：高分化19 例，中分化32 例，低分化33 例；肿瘤分期参考2009 年国际妇产科协会（FIGO）制定的标准［8］：ⅠA2 期13 例，ⅠB1 期12 例，ⅠB2 期17 例，ⅡA1 期13 例，ⅡA2 期10 例，ⅢA 期12 例，ⅢB 期7 例；浸润深度：浅肌层例34 例，深肌层50 例；伴淋巴结转移13例，无淋巴结转移71 例；人乳头瘤病毒（HPV）16/18 阳性70 例，阴性14 例。CIN 组年龄35～65 岁，平均（55.5±5.8）岁；肿瘤分期：ⅡA1 期12 例，ⅡA2 期10 例，ⅢA期12 例，ⅢB 期6 例。对照组年龄42～66 岁，平均（54.7±5.1）岁。三组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

纳入标准：①均经活检病理或术后病理学检查确诊；②均为初次诊治；③临床病理及随访资料完整；④患者均知情同意且签署知情同意书。排除标准：①合并其他器官恶性肿瘤；②合并上呼吸道感染等感染性疾病；③合并严重的心、肝等脏器功能不全。

1.2 方法

收集术中切取的部分病理组织，液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存。取约30 mg 组织标本，Trizol 法提取总RNA。以5μL总RNA为模板，使用TaqManMicro-RNA 反转录试剂盒（美国ABI 公司，批号：20160219）进行逆转录合成cDNA。miR-216b 特异性茎环引物，正向引物：5′-GCCGCGCTAAAGTGCTTA-3′，反向引物：5′-CACCAGGGTCCGAGGT-3′，U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′，FOXM1 上游 引物：5′-CCGCTCGAGGGACTGTTCTGCTCCTCATAG-3′，下游引物：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTGGCAGTCTCTGGATAATGATC-3′。荧光定量PCR 反应条件为：94℃，4 min；94℃，30 s；60℃，1 min；72℃，30 s；共40 个循环。总反应体系共20 μL，包括cDNA 2 μL，TaqDNA 聚合酶0.25 μL、上下游引物各0.1 μL、10×PCR缓冲液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，ddH2O 补至20 μL。所有反应均在实时定量PCR 仪（美国ABI 公司）上完成，每个样本重复3 次。采用相对Ct 值方法进行数据分析，miR-216b 表达水平相对于内参基因U6 的比值为2-ΔΔCt，且ΔCt=CtmiR-216b-CtU6，FOXM1相对定量表达水平ΔCt=CtFOXM1-CtU6。

1.3 观察指标

观察三组miR-126b 及FOXM1 表达情况，miR-126b 及FOXM1 表达与临床病理特征之间的关系及其相关性分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析、SNK-q 法检验，两组间比较采用t 检验；相关性分析采用Pearson 线性相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组miR-126b 及FOXM1 表达比较

病例组miR-126b 表达水平显著低于CIN 组及对照组，FOXM1 表达水平显著高于CIN 组及对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。CIN 组miR-126b水平显著低于对照组，FOXM1 水平显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 三组miR-126b 及FOXM1表达比较（±s）

表1 三组miR-126b 及FOXM1表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与CIN 组比较，#P＜0.01。miR-126b：微小RNA-216b；FOXM1：叉头框蛋白M1；CIN：宫颈上皮内瘤变

2.2 miR-126b 及FOXM1 表达与临床病理特征之间的关系

miR-126b 及FOXM1 表达与FIGO 分期、肿瘤分化程度及浸润深度有关（P＜0.05），与年龄、病理类型、有无淋巴结转移及有无HPV 16/18 感染无关（P＞0.05）。见表2。

2.3 相关性分析

miR-126b 水平与FOXM1 水平呈负相关（r=-0.694，P=0.001）。

表2 miR-126b 及FOXM1 表达与临床病理特征之间的关系（±s）

表2 miR-126b 及FOXM1 表达与临床病理特征之间的关系（±s）

注：miR-126b：微小RNA-216b；FOXM1：叉头框蛋白M1；FIGO：国际妇产科协会；HPV：人乳头瘤病毒

3 讨论

宫颈癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，中晚期患者预后更差。近年来，随着对宫颈癌分子机制研究的深入，新生物学标志物的发现及新技术的临床应用，患者的生存率提高，死亡风险降低［9］。但目前宫颈癌发生发展的分子机制尚不清楚，仍需寻找关键的诊断和治疗的分子生物靶点。研究显示，多种miRNA 如miR-375、miR-101 参与调控子宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭过程［10-11］。miR-216b 在胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中均存在表达异常，参与肿瘤的增殖、浸润和转移等过程的调控［12-13］。

本研究结果显示，病例组miR-126b 表达水平低于CIN 组及对照组，提示miR-126b 可能作为一种肿瘤抑制性miR，参与宫颈癌的发生发展过程。有学者在Hela、SiHa 及C33A 等宫颈癌细胞系中也发现miR-126b 表达下调现象［14］，与本研究结果一致。但miR-126b 过表达可促进肿瘤细胞的增殖并抑制凋亡过程。目前miR-126b 表达下调的机制尚不清楚，可能与编码基因的突变或其他因子转录后调控有关。有研究报道［15］，长链非编码RNA CCAT2 可以作为分子海绵结合miR-126b，抑制miR-126 功能，促进肿瘤细胞的增殖和转移。miR-126b 可以靶向调控自噬相关基因Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表达［16］，Beclin-1 表达下降和LC3-Ⅱ表达升高共同导致细胞自噬功能降低，促进肿瘤的发生发展。本研究结果显示，FIGO 分期越高、分化越差、肌层浸润越深，miR-126b 水平越低，提示miR-126b 水平能够反映病情严重程度，有可能成为新的相关肿瘤标志物。

FOXM1 在促进细胞周期G1/S 期和G2/M 期转换中发挥重要作用。本研究结果显示，病例组FOXM1 表达水平高于CIN 组及对照组，提示其可能与FOXM1 mRNA 的3′非编码区的miR 结合减少有关。在胶质瘤中，miR-876-5p 结合FOXM1 mRNA 后，抑制FOXM1表达，进而抑制肿瘤的进展［17］。此外，FIGO 分期越高、分化越差、肌层浸润越深，FOXM1 表达水平越高，提示FOXM1 可反映疾病严重程度、提示不良预后等。

高危型HPV 感染，如HPV 16、18 型，是宫颈癌发病的重要原因。本研究结果显示，HPV 感染与miR-126b 及FOXM1 表达水平无明显相关性，提示单纯HPV 感染并非是导致宫颈恶性转变的唯一因素，其他病因如基因突变、遗传易感性等均可能参与宫颈癌的发生发展［18］。此外，本研究结果显示，miR-126b 水平与FOXM1 水平呈负相关，提示FOXM1 可能作为miR-126b 的靶基因，受到miR-126b 的负向调控。骨肉瘤组织中也发现miR-126b 能结合FOXM1 mRNA的3′非编码区，抑制FOXM1 mRNA 的翻译过程，进而抑制肿瘤的增殖、浸润和转移［19-20］。但一种miR 可能存在多种靶基因，宫颈癌中FOXM1 是否是miR-126b的靶点及二者是否在宫颈癌发生发展过程中发挥关键作用，有待深入研究。

综上所述，宫颈癌组织中miR-126b 及FOXM1均异常表达，两者共同参与宫颈癌的发生发展过程，有可能成为宫颈癌诊断、治疗及预后评估的新肿瘤标志物。