加味逍遥散对肝癌细胞凋亡及钙离子的影响

王 昆，王瑶瑶，杨 茂，李滕仙，陈昱江

目前，全世界每年约1 400万人患肿瘤，约800万人死于恶性肿瘤，新发肝癌患者约占0.50左右[1]，而中国恶性肿瘤发生位居全球恶性肿瘤中等偏上水平[2]。据2015年中国癌症统计数据显示，肝癌发病率居恶性肿瘤第4位，死亡率居第3位[3]。全世界对抗肿瘤药物的研究非常关注，从中医药本身而言，如何提高患者的生存质量，减少痛苦是现阶段研究的出发点之一。肝癌在中医学中属于肝积、臌胀、积聚等病范畴。中药健脾养阴、活血除癥、软坚散结，是治疗肝癌的主要论治法则[4-6]。根据临床有经验老中医，对传统经典方剂逍遥散进行加味，该研究观察其对离体肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用及对细胞内钙离子的影响，初步探讨加味逍遥散的抗癌机制。

1 材料与方法

1.1材料肝癌SMMC-7721细胞株由昆明细胞库提供；顺铂购自上海旭东海普药业有限公司；加味逍遥散由北柴胡、当归、白芍、白术、茯苓各12克及生姜、炙甘草、薄荷、党参、法夏、陈皮、白马骨、茵陈、山楂各6克组成，所用中药一次性备齐，经鉴定符合药典用药规定，购自同济堂药房；HYCLONE DMEM培养基、标准Hyclone胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司；0.002 5 Hyclone胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)及PBS购自北京索莱宝公司；酶标仪(ZS-3型)购自北京新风机电公司；ANNEXIN V-KFLUOR647细胞凋亡检测试剂盒(CAT NO.KGAV113-20ASSAYS)、钙离子分析指示探针Fluo-3(CAT NO.KGAF023-1)购自南京凯基公司；CO2培养箱(MCO-175型)购自日本三洋公司；激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 肝癌SMMC-772l细胞在含10%胎牛血清的培养液中培养，培养条件为37 ℃、5% CO2、饱和湿度。取对数生长期的细胞，按不同实验要求进行。

1.2.2实验分组 空白对照组；顺铂阳性对照组(0.03 mg/ml，顺铂组)；加味逍遥散各剂量组:低剂量组(10 mg/ml)、中剂量组(20 mg/ml)、高剂量组(40 mg/ml)。以上中药提取物，生药浓度均为1 g/ml。中药提取物经高速离心取上清液(3 500 r/min,10 min,2次;13 000 r/min,10 min,1次)，0.22 μm的微孔滤器除菌，加过滤的饱和NaHCO3调(pH 7.0左右)稀释，新鲜配制使用。

1.2.3MTT法检测细胞增殖 待细胞进入对数生长期后，传至96孔板(NEST)，一次需要一块或根据实验需要调整，做药毒性实验MTT，MTT配置(50 mg MTT,溶解于10 ml培养基中)，0.22 μm(millpore)滤器过滤后使用。加入不同浓度含药培养基，培养48 h，加入MTT，20 μl/孔，培养4 h，抽出培养液，加入DMSO 150 μl/孔，低速震荡5 min，450 nm波长读取吸光度值。细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD值-实验组0D值)/对照组OD值×100%。

1.2.4细胞凋亡检测 进行细胞计数，调整细胞为1×105个/ml，按2 ml/孔加入6孔板中，贴壁培养24 h，去除培养基，PBS漂洗后，加入无血清培养基，同化培养24 h，去除培养基，PBS漂洗后，加入对应含药培养基，干预48 h，去掉孔板中培养基，PBS漂洗3次，使用0.3%胰蛋白酶(不含EDTA)消化5 min，细胞变圆脱落后收集至2 ml离心管中，2 000 r/min离心5 min，去掉上清液，用含2%BSA的PBS溶液重悬细胞，2 000 r/min再次离心5 min，去掉上清液。加入500 μl的Binding buffer重悬细胞。加入5 μl Annexin V-Kfluor 647和7-AAD，混匀。避光，室温，反应5～15 min，流式细胞仪检测，激发波长650 nm，最大发射波长665 nm，Annexin V-Kfluor 647的红色荧光FL4通道检测，激发波长546 nm，最大发射波长647 nm，7-AAD用FL3通道检测。

1.2.5激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内钙离子 正常培养至生长对数期，PBS漂洗后，用胰酶消化3 min，待细胞变圆脱落后，加入完全培养基终止消化，吹打重悬。进行细胞计数，调整细胞为1×105个/ml，按0.5 ml/孔加入6孔板中，贴壁培养24 h，去除培养基，PBS漂洗后，加入无血清培养基，同化培养24 h，去除培养基，PBS漂洗后，加入对应含药培养基，干预48 h。配制Fluo-3工作液：2.5 μl 1 mmol/L Fluo-3+996.5 μl 1640得到1 ml 2.5 μmol/L Fluo-3，再加入1 μl F-127混匀备用。去掉培养皿中培养基，Hank′s漂洗3次，以200 μl/皿加入Fluo-3工作液，37 ℃孵育30 min。去掉Fluo-3工作液，Hank′s漂洗3次，加入无血清1640培养基，37 ℃孵育30 min。激光共聚焦检测，激发波长506 nm，拍照取图。

2 结果

2.1MTT法检测结果结果显示，与空白对照组比较，顺铂组在对SMMC-7721肝癌细胞作用48 h后具有抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖的作用(P<0.001)；加味逍遥散的低、中、高剂量组(10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml)与空白对照组比较均显示对肝癌SMMC-7721细胞增殖有一定的抑制作用，并且这种抑制作用随着剂量的增大而逐渐增强，差异均有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 加味逍遥散不同浓度对SMMC-772l肝癌细胞增殖抑制作用的量效关系

x～y表示采用LSD法多重比较时两组抑制率平均值之差

2.2流式细胞仪检测结果加入药物后显示，空白对照组以大量活细胞为主，凋亡率为0.026；顺铂组的凋亡早期及晚期细胞明显增多，凋亡率为0.820；加味逍遥散高剂量组的坏死细胞和凋亡细胞也增多，凋亡率为0.276；加味逍遥散中剂量组的坏死细胞和凋亡细胞均有增多，但不如高剂量组明显，凋亡率为0.202；加味逍遥散低剂量组的坏死细胞和凋亡细胞有少量增多，凋亡率为0.096(图1)。说明加味逍遥散对肝癌SMMC-7721细胞有抑制作用，并随着浓度的变化而变化。

2.3激光共聚焦检测结果实验显示,加入顺铂时，荧光强度增强明显。加入加味逍遥散不同剂量的荧光反应强度不同，当加入高剂量时，荧光强度增强明显；加入中剂量时，荧光强度有增加，但不明显；而加入低剂量时，荧光强度没有变化。而且当荧光强度增强后，并没有立刻又下降。见图2。

3 讨论

肿瘤的发病率日趋上升，治疗肿瘤已经成为刻不容缓的课题。现代医学治疗肿瘤,主要是西医学的手术切除、化学药物和放射治疗。近年在临床治疗肿瘤的大量资料积累下，中医药在治疗肿瘤上，无论是对癌细胞的直接杀伤，还是通过提高免疫力来抑制肿瘤细胞的生长，都有不可忽视的作用[7-9]。而且中医的整体治疗观念和中药的多途径药理作用决定了中医药在治疗肿瘤中具有其独特的优势。逍遥散是中医传统名方，具有健脾益气、调正补虚、提高机体免疫力的作用，根据临床经验对其进行加减，针对性的治疗肿瘤及其并发症，有很好的效果[10-12]。

图1 对SMMC-772l肝癌细胞凋亡的影响

Q1:坏死细胞;Q2:凋亡晚期细胞;Q3:活细胞;Q4:凋亡早期细胞；A:空白对照组;B:顺铂组;C:加味逍遥散高剂量组；D:加味逍遥散中剂量组；E:加味逍遥散低剂量组

图2 作用于SMMC-772l肝癌细胞后钙离子荧光强度表现 ×200

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,其治疗是研究的重点。 恶性肿瘤细胞具有无限制性增生的特点,这是区别于正常细胞最显著的生物学特征,因此,抑制肿瘤细胞增生,诱导其凋亡成为治疗的最终目的。在本实验中，加味逍遥散各个剂量组均对离体肝癌SMMC-7721细胞有抑制作用，并随着浓度的变化而变化。细胞无限制性增生是通过细胞分裂、经历无数细胞周期来实现的,当细胞周期发生障碍时,细胞增生将受到抑制。流式细胞检测显示肝癌SMMC-7721细胞随着中药浓度的增高，凋亡率逐渐增高。这些都说明了加味逍遥散对离体肝癌SMMC-7721细胞有抑制作用，其发生机制可能是通过影响肝癌细胞生长周期来完成，今后可从周期的几个阶段分别观察其具体影响从而深入研究。该实验是将加味逍遥散直接作用于细胞，而该药为中药复方煎剂，在作用于肿瘤细胞时，可能存在改变细胞环境、有效成分及浓度，因此得到的结果会受一定的影响，正如在流式细胞检测结果中当高剂量中药加入后，除了细胞凋亡率明显增加以外，也出现坏死细胞明显增加，因此今后也将从这些方面进一步深化研究。

目前提到细胞内Ca2+是一种重要的第二信使,参与调节细胞膜的通透性,影响环核苷酸及磷酸肌醇代谢,调控酶活性。Ca2+本身作为一种凋亡信号,可调节Ca2+敏感的关键酶如蛋白激酶、磷脂酶、核酸内切酶及谷氨酰氨转移酶等诱导凋亡。在实验中，当加入加味逍遥散高、中剂量时，细胞内钙离子荧光强度增加，特别是加入高剂量的中药时荧光强度增加明显，而且随后并未立刻下降，说明在该药的中、高剂量加入时，可增加细胞内钙离子的浓度，影响细胞内钙离子稳定，且暂时无法通过自身调节而使钙离子浓度恢复正常状态，这可能就是加味逍遥散直接抑制离体肝癌SMMC-7721细胞增殖、诱发其凋亡的作用机制。但对细胞膜通透性的影响、细胞内钙离子浓度的调节范围及具体作用时间尚不清楚，有待进一步研究。