基于响应面分析法优化甘蔗梢提取物中黄酮分离工艺研究

李新莹，薛海玲，李 冉，杨学军

(西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041)

甘蔗为禾本科甘蔗属C4作物，主要集中种植在从北纬25°至南纬25°的范围内[1].甘蔗不仅是重要的糖料作物，同时也是药食两用的植物.《本草纲目》记载：“蔗，脾之果也，其浆甘寒，能泻火热”[2].现代中医认为，甘蔗味甘性寒，有健骨助脾、止咳化痰、除烦解酒、润肠通便等功效.近年来有研究表明，甘蔗及其提取物中含有黄酮和花青素等生物活性成分[3-5]，其中黄酮类化合物具有较强的抗氧化性能，能调节血糖血压，并在调节人体代谢、抗动脉粥样硬化以及细胞保护等方面都有重要的作用[6-8].不过，甘蔗梢通常被人们认作是制糖工业的废弃物，只是将其直接丢弃或仅用作饲料和肥料，没有充分利用.另一方面，大孔吸附树脂是一类化学性质稳定，孔径和比表面积都较高的具有三维网状立体空间孔结构的高分子聚合物，能通过物理作用从水溶液中选择性吸附有机物质，从而达到分离提纯的目的[9-10].大孔吸附树脂因具有较大的吸附容量，较快的吸附速度，较好的吸附选择性以及简便的再生处理方法等优点，得到了人们的广泛关注[11-14].近年来，关于黄酮分离的相关研究有一些报道，但以制糖工业废弃物甘蔗梢为研究对象，并结合响应面分析法优化大孔吸附树脂分离其中黄酮成分的工艺研究还较少.因此本实验拟通过旋转中心组合试验设计原理(CCD)对分离过程参数进行优化，所得结果可为甘蔗梢资源高效开发利用等提供理论依据和技术支撑.

1 材料与仪器

1.1 材料

甘蔗梢提取物，甘蔗(Saccharum sinensis Roxb.)取其梢后由本实验室自制。D141型大孔吸附树脂，购自中蓝晨光化工研究院。Diosmin标准品，购自成都曼斯特生物科技有限公司。无水乙醇，氢氧化钠，硝酸铝，亚硝酸钠等，均为国产分析纯。

1.2 仪器

FW135万能高速粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);TU1810紫外分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司);KQ-50DE型数控超声清洗器(昆山超声仪器有限公司);DZF-2B型电热真空干燥箱(北京永光明医疗仪器厂);FA/JA型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);RE-3000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);GM-0.33Ⅱ型隔膜真空泵(天津腾达过滤器件厂)。

2 实验方法

2.1 分离工艺路线

从甘蔗梢中分离黄酮成分的工艺路线见图1.

图1 从甘蔗梢中分离黄酮成分的工艺路线Fig.1 Separation process for obtaining flavonoids from the sugarcane tips

2.2 黄酮成分分析方法

2.2.1 绘制黄酮标准曲线

黄酮标准曲线的绘制参照文献[15-16].

2.2.2 样品黄酮含量的测定

将柱层析后收集的95%乙醇洗脱液浓缩至干，按照2.2.1方法于最大吸收波长(355 nm)处测定溶液的吸光度值，通过回归方程(Y＝0.01769X+0.525，R2＝0.9958)计算黄酮含量.

2.3 单因素试验

运用大孔吸附树脂层析法对甘蔗梢提取物中黄酮成分进行分离，固定上样pH值＝5，流速为2 BV/h，洗脱体积为3BV，每次称取一定量的相当于1 000 g甘蔗梢原料提取得到的甘蔗梢提取物，以D141型树脂为分离介质，分别考察不同pH值、流速以及洗脱体积等对黄酮分离效果的影响(参数设置见表1).

表1 单因素实验条件Table 1 Single factor analysis for separation of flavonoids

2.4 响应面法优化

在单因素试验的基础上，根据CCD原理，以pH值、流速、洗脱体积三个因子为自变量(分别用X1，X2，X3表示)，依次按照 -1.68， -1，0， +1， +1.68 的顺序编码，以黄酮含量为响应值设计三因素三水平试验(试验因素与水平设计表参见表2)，然后采用Design expert 7.1.3软件对试验结果进行统计分析，运用式(1)公式得出回归方程，变量通过式(2)进行编码[16].

表2 黄酮分离过程CCD设计因素与水平表Table 2 Factors and levels for flavonoids separation of central composite design

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 上样pH值对分离效果的影响

取一定量的甘蔗梢提取物装入填有D141型大孔吸附树脂的层析柱中，调节上样液pH值分别为1、3、5、7、9，先用蒸馏水和体积分数为30%的乙醇溶液梯度洗脱，再以流速为2BV/h、洗脱体积为3BV的95%的乙醇洗脱液洗脱，根据上述2.2方法计算黄酮含量，上样pH值对黄酮含量的影响结果如图2所示.根据图2可以看出，上样pH值对黄酮含量有较为显著的影响.当流速和洗脱体积一定的情况下，pH值从1～9，黄酮含量先增大后减小，且pH＝5时黄酮成分含量最高，pH值＞7后黄酮含量开始下降，pH＝9时含量下降明显.说明碱性条件不利于甘蔗梢黄酮成分的吸附与分离，这可能是由于黄酮有多个羟基而具有弱酸性，在酸性溶液中更易于吸附的缘故.因此控制pH值为5左右为最佳条件.

图2 上样pH值对黄酮含量的影响Fig.2 Effects of pH value on the flavonoids content

3.1.2 流速对分离效果的影响

固定上样液pH值为5，洗脱体积为3BV，研究不同流速(1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h)对甘蔗梢提取物中黄酮成分分离效果的影响，结果如图3所示.根据图3可知，流速从1 BV/h至5 BV/h，黄酮含量先快速增大，而后逐渐减小，当流速为2 BV/h时黄酮含量达到最大值.说明过快的流速反而不利于黄酮成分的分离，这可能是由于快的流速导致黄酮与大孔吸附树脂的作用不够充分，未将黄酮成分充分洗下.因此选择1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h为流速的响应因素水平.

图3 流速对黄酮含量的影响Fig.3 Effects of flow rate on the flavonoids content

3.1.3 洗脱体积对分离效果的影响

考察不同洗脱体积(1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV)对甘蔗梢提取物中黄酮分离效果的影响，固定上样液pH值为5，流速为2 BV/h进行柱层析，根据上述2.2方法计算黄酮含量，所得结果如图4所示.由图4可以看出，洗脱体积对黄酮含量产生了一定的影响，总体而言随着洗脱体积的增加，黄酮含量也相应的变大，这可能是因为洗脱体积较小时，洗脱液不能将黄酮充分溶出.当洗脱体积达到3BV后黄酮含量达到较高水平，继续增加洗脱体积对黄酮含量升高影响不明显，这主要是由于增加洗脱体积可以提高溶质和溶剂两相体系的浓度梯度，有利于传质.但从节约溶剂和后续分离纯化的角度考虑，不适宜选择过多的洗脱溶剂量，因此选择2BV～4BV为洗脱体积的考察范围.

图4 洗脱体积对黄酮含量的影响Fig.4 Effects of column volume on the flavonoids content

3.2 响应面法优化

响应面分析方案与实验结果参见表3，通过对表3中实验数据进行多元回归拟合，得到黄酮含量对3因素变量间的多项式回归方程如式(3)所示：

应用多项式回归方程和方程的各因子进行方差分析，结果见表4.由表4可以看出，以黄酮含量为响应值，回归方程预测模型的 F值为58.37，P值 ＜0.0001，达到极显著水平;失拟项 P值为0.1033＞0.05，差异不显著，说明无失拟因素存在，实验误差小;决定系数R2＝0.9813，说明回归方程模型与实验拟合度较好，可用回归方程代替真实试验点对大孔吸附树脂分离甘蔗梢提取物中黄酮工艺的分析和预测.一次项 pH值(X1)和流速(X2)的 P值均小于0.0001，说明对大孔吸附树脂分离黄酮的影响均达到极为显著的水平.一次项中的洗脱体积(X3)，二次项中的pH值(X12)、流速(X22)和洗脱体积(X32)对大孔吸附树脂分离黄酮的影响均显著(P＜0.01).交互项中各因素的P值均小于0.05，说明对大孔吸附树脂分离甘蔗梢提取物中黄酮成分的影响也均达到了较为显著的水平.有F值和P值可知，三个因素对甘蔗梢提取物中黄酮分离效果影响为：洗脱体积(X3)＞pH值(X1)＞流速(X2).

表3 黄酮分离CCD分析方案与实验结果Table 3 Results of CCD for separation of flavonoids

由所得回归方程，可绘制出响应值与上样pH值、流速、洗脱体积的三维关系图(如图5a，6a和7a所示)，以及对应的等高线图(如图5b，6b和7b所示).由图5可以看出，当固定流速时，随着上样pH值的增加，黄酮含量不断增大，当达到峰值后又逐渐变小.图5a显示，黄酮含量在上样pH值的0～+1水平和流速的0～+1水平之间有最大值.由图5b可知，二维等高线接近椭圆形，同时PX1X2＝0.0153＜0.05，说明上样pH值和流速的交互作用对黄酮含量的影响显著.由图6可知，当pH值一定时，随着洗脱体积的不断增加，分离得到黄酮的量逐渐也相应的变大，当洗脱体积超过4BV时，黄酮含量增加趋势变缓，且PX1X3＝0.0030＜0.05，说明上样pH值和洗脱体积对黄酮含量的影响也显著.另外，由图7可知，当流速一定时，分离得到黄酮的量随着洗脱体积的增加而增加，洗脱体积轴向等高线较流速轴向等高线密集，说明黄酮含量对洗脱体积的变化较敏感，且响应曲面整体坡度较为陡峭，同时PX2X3＝0.0088＜0.01，说明流速和洗脱体积的交互作用对黄酮含量的影响较显著.

表4 黄酮分离回归方程方差及显著性检验分析Table 4 Analysis of variance and established regression model for flavonoids separation

图5 pH值和流速对黄酮分离效果影响的响应面和等高线Fig.5 Effects of pH value and flow on flavonoids separation as the response surface plot and contour plot showing

图6 pH值和洗脱体积对黄酮分离效果影响的响应面和等高线Fig.6 Effects of pH value and elution volume as the response surface plot and contour plot showing

图7 流速和洗脱体积对黄酮分离效果影响的响应面和等高线Fig.7 Effects of flow rate and elution volume as the response surface plot and contour plot showing

通过Design expert 7.1.3软件对试验结果进行分析，得出甘蔗梢提取物中黄酮分离的最佳工艺条件为：上样pH值6.71，流速2.50 BV/h，洗脱体积4.00 BV.在此优化条件下，进行3次平行试验验证，结果显示甘蔗梢提取物中黄酮收率为193 mg/kg，与预测值194.16 mg/kg接近，说明建立的模型对甘蔗梢提取物中黄酮成分的分离工艺具有一定指导意义.

4 结论

本文采用大孔吸附树脂层析法对甘蔗梢提取物中黄酮成分进行分离，通过单因素以及三因素三水平响应面分析试验，建立了甘蔗梢提取物黄酮分离工艺条件的二次多项式数学模型，分析了各因素对响应值的影响，确定了黄酮分离的最佳工艺条件为：以大孔吸附树脂与提取物干质量之比为20：1上样，调节上样液pH值为6.71，D141型大孔吸附树脂为分离介质，梯度洗脱(洗脱剂使用顺序为：水、体积分数分别为30%和95%的乙醇溶液)，流速为2.50 BV/h，洗脱体积为4.00 BV，此条件下黄酮收率为193 mg/kg，且不同分离条件对黄酮含量影响由大到小的顺序为：洗脱体积＞pH值＞流速.因此，利用响应面分析法得到的结果较为准确可靠，可用于大孔吸附树脂分离甘蔗梢提取物中黄酮工艺条件的优化，为制糖工业废弃物甘蔗梢中有效化学成分的研究开发提供了理论依据.