HPIP在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

王海璐 田淞宇 陈秀玮 王榆平 侯思宇

子宫内膜癌是发生于子宫内膜上皮的恶性肿瘤，最常见为子宫内膜腺体来源，是女性生殖类三大恶性肿瘤之一，其发病率约占女性全身恶性肿瘤的7%，约占女性生殖道肿瘤的20%～30%，居女性生殖道恶性肿瘤的第四位[1]。子宫内膜癌的发生率呈逐年上升并有年轻化的趋势[2]。每年增加2.4%，死亡率增加了1.9%，5年和10年的相对存活率分别是82%和79%[3-5]。子宫内膜癌的诊刮为盲刮，对于较小的病灶容易出现漏诊，有文献报导这种盲刮的漏诊率可达35%[6]，即使有经验的专家刮诊时也有10%～25%的宫腔疾病被漏诊，尤其是宫底、宫角等特殊部位[7]。子宫内膜癌死亡率较高，仍然是1个相对严重的问题，确定子宫内膜癌的有效生物学标志，对于内膜癌患者提供早期诊断和提供靶向治疗，发现特异性生物学标志，可以有效预测子宫内膜癌的预后及发展，值得我们去重视。

1 材料与方法

1.1 对象和选取组织

选取2011年1月至2012年1月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院收治的80例诊断为EC患者的包埋病理组织样本，。所有EC患者术前没有接受任何放化疗。内膜癌手术范围包括次广泛全子宫切除+双附近切除术+盆腔淋巴结清扫术。手术切除后行病理检查，判断组织学类型，细胞分级，基层浸润深度，脉管转移和淋巴结转移。所有研究患者手术病理分期和组织学分期基于2009年国际妇产科联盟(Federation international of gynecology and obstetrics,FIGO)。另取2016年1月至2017年1月妇科手术切除或刮宫的子宫内膜标本，正常子宫内膜组织10例，临床资料及病理资料收集完整。

1.2 试剂与方法

Anti-PBXIPI antibody(ab84752),购自Abcam公司。PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物、二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化常规试剂：PBS缓冲液，氯化钠，二甲苯，酒精，碳酸氢二钠过氧化氢，苏木精，蒸馏水等均由哈医大形态中心提供。

1.3 免疫组织化学

标本采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)免疫组化染色法来研究HPIP在EC和正常内膜组织中的表达。①切片：对采集的组织蜡块连续切片，在温水中展开，用载玻片捞取组织切片；②脱蜡、水化：置入60 ℃恒温箱中预热20 min，依次浸入二甲苯(10 min 2次)、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min；③洗片：用蒸馏水冲洗5 min，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min；④阻断内源性过氧化物酶：组织玻璃片浸入3%过氧化氢中15 min，用PBS冲洗3次；⑤抗原修复：将组织置入抗原修复盒中，倒入0.01 mol/l枸橼酸钠缓冲液(PH6)，在高压锅内沸水加热4 min，冷却至常温，PBS缓冲冲洗液3次；⑥滴加一抗体：每张切片滴加HPIP多克隆抗体(稀释比例1∶200)完全覆盖组织，阴性加蒸馏水，铺于孵育湿盒在4 ℃的冰箱中过夜，PBS缓冲液洗冲3次，每次3 min；⑦滴加二抗体：用滤纸去除多余的PBS缓冲液，滴加PV山羊抗兔IgG/HRP聚合物，平铺于湿盒中，室温孵育30 min，PBS缓冲液3次，每次3 min；⑧DAB染色：新配置的DAB染色剂，滴加在每张玻片上，置于显微镜显色情况，显微镜观察确定反应终止时间，蒸馏水冲洗干净；⑨苏木精复染：苏木精复染1～2 min，用蒸馏水冲洗干净，在显微镜下染色满意后，依次75%乙醇(5 min，1次)、85%乙醇(5 min，1次)、95%乙醇(5 min，1次)，100%乙醇(10 min，2次)，脱水干燥，中性树胶封片，置入80 ℃恒温烤箱内烤干。

1.4 实验结果评价标准

全部染色组织切片由哈尔滨医科大学病理学专家在双盲法下独立判断。染色程度评分：0分(无染色)、1分(弱染色)、2分(中度染色)、3分(强染色)。表达强度：0分(0%～5%阳性细胞)、1分(5%～25%阳性细胞)、2分(26%～50%阳性细胞)、3分(51%～75%阳性细胞)、4分(>75%阳性细胞)。最终评分相乘。

1.5 统计学分析

统计学分析数据应用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析，正常组织HPIP蛋白的表达和EC中HPIP的表达存在明显差异，EC患者的HPIP蛋白表达与临床病理资料的关系应用卡方检验。P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 HPIP蛋白在正常内膜组织和EC组织中表达情况

免疫组化实验显示：HPIP在正常内膜组织和EC中的表达阳性颗粒都分布在胞质中，呈棕黄色。经过统计学的分析，正常内膜组织中的HPIP阳性表达率为10%(1/10)。EC组织中HPIP阳性率73.7%(59/80)。两者的表达情况具有统计学意义。

2.2 HPIP表达与EC临床病理特征的关系

HPIP蛋白在EC组织中的表达与患者年龄、肿瘤浸润深度和肿瘤脉管浸润无显著关系(P>0.05)，但是与手术病理FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，见表1。

表1 HPIP在EC中的表达与临床病理特征的关系/例

3 讨论

HPIP蛋白也称前B细胞转录因子相互作用蛋白[8]，该蛋白既是1种核质穿梭蛋白也是1种微管结合蛋白[9]，随着对HPIP细胞研究的不断深入，发现造血前B细胞白血病转录因子(PBX)相互作用蛋白(HPIP/PBXIP1)在癌症的侵袭和转移中起着重要的作用。证据显示HPIP与肿瘤关系极其密切，具有一定的癌基因特性，它在许多人类恶性肿瘤中呈现高表达状态，如乳腺浸润性导管癌[10]、肝癌[11]、胃癌[12]、口腔癌[13]、结直肠癌[14]，并且在肿瘤的发生、迁移、侵袭和转移中起着重要作用。与恶性肿瘤相比，HPIP蛋白在正常子宫内膜组织中是否存在差异性表达，从而确定其与子宫内膜癌的发生和发展有关。研究HPIP蛋白与子宫内膜癌的分级、分期、淋巴结转移、浸润深度、及患者的发病年龄等的相关性，从而确定其高表达可能促进子宫内膜癌的发生、发展。HPIP可能恶性肿瘤精准治疗的新突破[7]。

影响子宫内膜癌患者临床复发及其预后的危险因素主要有淋巴血管间隙浸润、子宫腔受累范围、基层浸润深度以及组织学分级[15]。其组织学分化越低，肌层浸润越深，盆腔淋巴结转移较多，其预后越差。研究表明，高、中、低分化的5年生存率分别为94%、84%、72%[16]。影响EC患者预后已知因素包括患者年龄、FIGO分期、组织学分级及手术治疗效果等。因此有必要对其免疫机制进行研究，旨在研究HPIP蛋白在子宫内膜癌中的表达意义。

本研究表明，HPIP蛋白高表达与肿瘤进展有密切的关系。HPIP可以作为EC进展及预后的1个独立的生物学标志。我们研究HPIP蛋白在EC的表达与其临床病理特征的相关性。我们采用免疫组化实验方法，观察EC组织和正常子宫内膜组织的HPIP蛋白的表达情况，实验数据统计分析显示HPIP蛋白高表达与EC临床分期、组织学分级、淋巴结转移显著相关。这些结果都表明HPIP蛋白在EC的发展中起着至关重要的作用，我们所研究的结果与之前HPIP蛋白在这种癌症中对于肿瘤发展的研究结果一致[2,17-18]。研究发现HPIP蛋白的表达在肿瘤的发生、发展中起着十分重要的生物学作用。

到目前的研究为止，一些研究可以解释HPIP蛋白促进肿瘤发生发展的机制，HPIP高表达导致某些癌基因的活化，例如细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D1[14]、而且最近证明HPIP蛋白在信号转导途径中起关键的作用,从而促进肿瘤细胞增殖。WANG等研究表明HPIP蛋白在P13K/ART信号转导中起着重要的作用，其调节多种生物学行为，例如细胞凋亡，肿瘤发生，细胞上皮间质转化[19]。一些研究也证明，HPIP蛋白可以在几种癌细胞中介导特异性雌激素受体信号的传导。FENG等推测HPIP蛋白可以激活结直肠癌细胞中MAPK/ERK通路，从而促进肿瘤的增殖和迁移[12]。这些研究提供了重要的信息，都可以证明HPIP蛋白在促进癌症的发生和肿瘤的发展的机制，HPIP高表达的患者有较差的预后。

HPIP蛋白抑制鳞状上皮细胞癌抗原9细胞系(SCC9)的分化和增殖，同时抑制质形成细胞系(NHEK)的碳酸脂质的迁移[13]。在体外敲出HPIP蛋白可以抑制癌细胞的生长在炎症浸润细胞中，HPIP蛋白的表达呈阳性[20]。在口腔鳞状细胞癌前病变组织中HPIP蛋白表达阳性细胞的数量明显高于Ki-67表达阳性的细胞数量，HPIP蛋白表达阳性细胞所在的区域被认为上皮细胞结构受到明显干扰。HPIP蛋白可能将应用于口腔癌抗癌疗法的潜在靶标[13]。有研究表明，HPIP蛋白促进肿瘤细胞迁移和侵袭，通过激活MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路来促进结直肠肿瘤细胞的增殖、迁移和上皮间质转换[12]，HPIP蛋白抑制结直肠癌细胞的凋亡，BCL2是HPIP调节细胞凋亡的关键。LY294002或PD98059治疗结直肠癌的机制是通过抑制AKT和ERK1/2信号蛋白的磷酸化，从而调节结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]。

本实验主要研究HPIP蛋白促进EC的发生、发展。此研究不足是研究的病例数量少，因此需要1个大的样本研究设计，结果会更加信服。进一步研究HPIP在EC中的作用，并且研究其作用通路及机制，确定HPIP是否结合其他信号蛋白改善EC患者预后。