尼莫地平经眼部给药后在大鼠体内的药物动力学表现

李 芳，茅 丹，代嫚嫚，张慧敏，马 群，白露雨，何 宁，2，3

1安徽中医药大学药学院药剂系，合肥 2300122安徽省中医药科学院药物制剂研究所，合肥 2300123中药复方安徽省重点实验室，合肥 230012

近年来，黏膜给药系统发展迅速。由于黏膜部位具有角质化程度低、通透性好、毛细血管丰富、吸收迅速等优点，因此可避免口服药物的首过效应，提高药物生物利用度[1]。研究显示，通过鼻腔[2- 3]、口腔[4- 5]、肠[6]等黏膜给药可以实现药物的全身治疗。眼部黏膜作为人体重要的黏膜，目前研究主要集中在治疗眼局部疾病[7]，主要包括眼部感染、干眼症、青光眼、视网膜病变等。眼部给药发挥局部作用的药物吸收途径主要包括角膜渗透和结膜渗透[8]。角膜是药物发挥局部作用的主要吸收途径，药物与角膜接触并渗入角膜，进一步进入房水经前房到达虹膜和睫状肌，被局部血管网吸收发挥局部作用。结膜内有着丰富的血管和淋巴管，药物经结膜吸收后，经巩膜转运至眼球后部，再经结膜血管网进入体循环，这一吸收途径不利于药物进入房水发挥局部治疗作用。眼部给药后药物还极易通过多种途径代谢消除[9]，主要包括：药物经泪液从眼表面清除；药液流入鼻泪管和鼻腔后快速吸收进入全身循环清除；经多种途径进入前房的药物会经房水循环入血消除；药物从房水还可经血房水屏障进入全身循环消除；进入眼后段的药物可经血视网膜屏障进入全身循环消除，因此，眼部局部给药的生物利用度一般都很低。基于眼部的特殊解剖生理学特征，以及眼部给药后药物可经多种途径进入体循环代谢清除的事实，我们认为经眼部给药可使药物直接吸收进入体循环，从而治疗全身性疾病。有研究表明，噻吗心安、匹鲁卡品等滴眼液在眼部局部给药后，血药浓度均较高，从而极易导致严重的心血管系统和呼吸系统不良反应，这也提示我们药物经眼部可进入全身循环[10- 11]。Chiou[12]研究发现，胰岛素等药物在吸收促进剂的存在下经眼部途径可实现全身给药。所以，药物经眼部跨屏障入血有望成为药物全身给药的新途径。

尼莫地平(nimodipine，NMD)是典型的第2代吡啶类钙拮抗剂，临床应用较多，能选择性扩张脑血管并缓解脑血管痉挛，是美国食品药品管理局批准的蛛网膜下腔出血引起的血管痉挛的唯一治疗药物，对脑卒中、偏头痛，急性脑梗死、心绞痛、心肌梗死、老年痴呆及突发性耳聋也有良好的疗效[13]。NMD现已上市的剂型有片剂、胶囊剂和注射剂。由于该药溶解度差，胃肠道给药后具有严重的首过效应，生物利用度较低[14]；静脉注射后在体内广泛分布，脾、肺和心脏等器官分布较多，而脑内浓度较低[15]。本研究以NMD为模型药物，比较了药物经眼部给药、静脉注射和灌胃给药后大鼠体内的药物动力学表现，探讨了药物经眼部给药后发挥全身治疗作用的可行性，以期为药物跨眼部屏障入血的研究提供理论依据，为具有全身治疗作用的眼用制剂的研究提供参考。

材料和方法

试剂和仪器NMD原料药(武汉远成共创科技有限公司，纯度>98.0%)；NMD标准品(中国食品药品检定研究院，批号100270- 201403，纯度99.7%)；尼群地平(nitrendipine，NTD)标准品(南京森贝伽生物科技有限公司，批号170826，纯度>98.0%)；NMD眼膏剂[自制，基质为黄凡士林∶羊毛脂∶液状石腊(8∶1∶1)的混合物，每克基质中含NMD 12.0 mg]；NMD口服溶液(自制，以50%的PEG 400作为溶剂，每毫升中含尼莫地平5.0 mg)；NMD注射液(自制，以乙醇∶PEG 400∶水=25∶45∶30的混合溶剂作为溶剂，每毫升中含NMD 5.0 mg)；甲醇和乙腈(美国Sigma公司，色谱纯)；水为去离子纯水，由Millipore纯净水发生器制得。LC- 20A 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，FA21021B十万分之一电子天平(上海越平科学仪器有限公司)，TG16A-WS台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，涡漩混合器(合肥艾本森科学仪器有限公司)，KQ- 50DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

实验动物健康雄性SD大鼠，体质量(180±20)g，试验动物中心提供[生产许可证号：SCXK(皖)2011- 001]。置于室温18～25 ℃，相对湿度40%～70%的条件下喂养。

色谱条件色谱柱：Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相∶乙腈-水(60∶40，V/V)；检测波长：236 nm；柱温40 ℃；流速1.0 ml/min；进样量：60 μl。

对照溶液和内标溶液的配制精密称取 NMD 对照品 10.0 mg，置 100 ml 的容量瓶中用甲醇稀释至刻度(100 μg/ml)作为贮备液，置4 ℃备用，工作液在使用前由贮备液逐级稀释制得。精密称取NTD对照品5.0 mg，置 25 ml 的容量瓶中用甲醇稀释至刻度(200 μg/ml)，随后将上述溶液用甲醇继续稀释成含NTD 10 μg/ml 的内标溶液。

血浆样品预处理精密吸取在室温下自然解冻的血浆样品100 μl，精密加入NTD(内标)溶液(10 μg/ml)10 μl，涡旋混合1 min，继续加入沉淀剂甲醇300 μl，涡旋振荡3 min，12 000 r/min离心10 min，进样分析。

专属性取大鼠空白血浆、NMD溶液、空白血浆外加一定浓度NMD和内标配制的模拟血浆样品、血浆样品，按“血浆样品预处理”项下方法处理后进样，记录色谱图。

标准曲线的制备取空白血浆90 μl，加入10 μl不同浓度的NMD对照品，使其浓度分别为0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/ml，按“血浆样品预处理”项下操作，进行高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析，记录样品和内标峰面积，以 NMD 的峰面积(As)与内标峰面积(Ai)比值(Y)对血浆中 NMD 的质量浓度(C)作线性回归。

精密度和准确度在适量空白血浆中加入 NMD的标准储备液，配成高(10.0 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、低(0.2 μg/ml)浓度的供试溶液各3份。按“血浆样品预处理”项处理后，进样分析，计算药物峰面积As和内标峰面积Ai的比值，以标准曲线求算实测浓度，与理论加入浓度比较，计算方法的准确度；每个浓度样品日内测定5份，计算日内精密度；连续测定5 d，计算日间精密度。

提取回收率在适量空白血浆中加入 NMD的标准储备液，配成高(10.0 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、低(0.2 μg/ml)浓度的供试溶液各5份，各浓度供试液均按“血浆样品预处理”及“色谱条件”项进行测定，记录峰面积A1。另取相同浓度的 NMD 标准溶液，不经提取处理直接进行 HPLC 分析，记录峰面积A2，由两者的比值A1/A2计算提取回收率。

血浆样品稳定性将高(10.0 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、低(0.2 μg/ml)3个浓度的NMD血浆样品经处理后放置在进样盘中(10 ℃)24 h，检查其放置稳定性；20 ℃ 室温放置 4 h，检测其室温稳定性；-86 ℃冰箱中反复冻融 3 次，检测其反复冻融稳定性。所有样品均按照“血浆样品预处理”项下方法处理，HPLC 测定，记录峰面积并按标准曲线计算药物浓度。

体内药物动力学实验采用随机数字表法将135只SD大鼠随机分为静脉注射(intravenous administration，iv)组(n=45)，眼部给药(intraocular administration，io)组(n=45)和口服灌胃(intragastric administration，ig)组(n=45)3组。io和iv给药剂量为5.0 mg/kg，ig组给药剂量为 10.0 mg/kg。实验前禁食12 h，不禁水。io组：将NMD眼用制剂滴入大鼠左、右眼的结膜内，于给药后 2、5、10、15、30、60、120、180、240 min 分别从大鼠股动脉取血样适量于含有肝素的离心管中，3000 r/min 离心 10 min 得血浆，血浆样品于-86 ℃冷冻保存，按“血浆样品预处理”项下方法处理后进样分析，并采用药动学软件DAS 3.2计算相关药物动力学参数。iv组：将自制的 NMD 注射液注入大鼠左侧股静脉，取血时间及处理方法同上。ig组：将NMD口服溶液剂灌胃给药，取血时间及处理方法同上。

结 果

专属性空白血浆、NMD对照品、空白血浆加对照品及大鼠给药后血浆样品的HPLC 色谱图见图1。在以上色谱条件下，血浆中的内源性物质不影响NMD与内标的分离测定，NMD和内标的保留时间分别为7.9和9.1 min，其中NMD和内标NTD的峰形对称，分离度良好，该方法具有较高的专属性。

标准曲线以 NMD的峰面积(As)与内标峰面积(Ai)比值(Y)对血浆中 NMD的质量浓度(C)作线性回归，如图2所示，得回归方程为Y=0.63C+0.02(r=0.9999)，表明血浆药物浓度在 0.05～10.00 μg/ml 内呈良好线性关系。本方法测得最低检测限为 0.02 μg/ml (S/N>3)，最低定量限为0.05 μg/ml (S/N>10)，其中，定量限的准确度为105.4%，精密度RSD为4.78%，表明精密度和准确度良好。

精密度和准确度低(0.2 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、高(10.0 μg/ml) 3 个浓度血浆样品的日内精密度均小于5.67%，日间精密度均小于10.52%，表明仪器精密度良好；准确度在85%～115%之间，符合生物样品分析测定的要求(表1)。

NMD：尼莫地平；NTD：尼群地平；HPLC：高效液相色谱法

NMD：nimodipine；NTD：nitrendipine；HPLC：high-performance liquid chromatography

A.空白血浆；B.NMD溶液；C.空白血浆+对照品；D.血浆样品

A.blank plasma；B.nimodipine solution；C.blank plasma + control；D.plasma sample

图1HPLC色谱图

Fig1HPLC chromatogram

图2NMD在大鼠血浆中的标准曲线

Fig2Standard curve of NMD in rats’plasma

提取回收率低(0.2 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、高(10.0 μg/ml)3个浓度的提取回收率分别为92.59%、100.42%、97.54%，均大于80%，表明该提取方法符合生物样品分析的要求(表2)。

血浆样品稳定性血浆样品在储存、反复冻融后及测定过程中的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)均小于12%，表明NMD血浆样品在上述条件下具有良好的稳定性。

药物动力学实验各组大鼠给药后其平均血药浓度-时间曲线见图3，利用药动学软件DAS 3.2，分别对测得的3种给药途径的血药浓度数据进行模型拟合，采用非房室模型计算主要药物动力学参数，结果显示，经眼部给药、灌胃给药的Cmax分别为0.52、0.20 μg/ml，tmax均为5.0 min；经眼部给药、灌胃给药、静脉给药的AUC0-t分别为21.10、52.58、5.98 μg/(ml·min)。灌胃给药的绝对生物利用度仅有 5.69% (按相同的给药剂量即 5 mg/kg 计算)，眼部给药的绝对生物利用度达到 40.13%。

表1 精密度和准确度测定结果(%)Table 1 Precision and accuracy of the method(%)

表2 大鼠血浆中尼莫地平的提取回收率 (n=5)Table 2 The extraction and recovery of nimodipine in rats’plasma (n=5)

A1：血浆样品峰面积；A2：标准溶液峰面积；RSD：相对标准偏差

A1：peak area of plasma sample；A2：peak area of standard solution；RSD：relative standard deviation

讨 论

目前，检测生物样品中NMD的方法有很多，包括HPLC、液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)等。本实验中建立的用于测定大鼠血浆中NMD含量的HPLC法具有精密度和准确度高、专属性强以及简单易操作等优点。NMD与内标的萃取回收率符合生物样品分析方法的要求，与血浆中内源性物质峰均能得到良好的分离，峰形较好。因此建立的含量测定方法可用于NMD在大鼠体内的药物动力学研究。

本实验主要利用眼部给药后大部分药物可经结膜血管网、房水循环、血房水屏障、血视网膜屏障等途径进入全身循环而代谢消除的事实，探索NMD经眼部给药治疗全身疾病的可行性，将治疗局部疾病的劣势转化为治疗全身疾病的优势。眼部给药与注射给药途径相比，具有使用方便，患者顺应性好的优点；与口服给药途径相比，可避开首过效应，提高药物的生物利用度。

一些心脑血管疾病患者发病时大多伴随恶心、呕吐等症状，胃肠道功能较为低下，导致药物吸收程度降低。一般而言，药物的眼部黏膜吸收并不依赖于胃肠道的生理状态，故经眼部给药后仍可能有较高的生物利用度。本研究中，在眼部给药剂量仅为灌胃给药一半的情况下，NMD经眼部给药后，药物在大鼠血浆中的Cmax明显高于灌胃给药，且灌胃给药后NMD的绝对生物利用度仅有 5.69%，而眼用给药制剂的绝对生物利用度高达 40.13%，是灌胃给药的 7.06 倍，由此可见经眼部给药相比灌胃途径有着更高的生物利用度。由于NMD按照正常剂量口服给药后的生物利用度极低，使得给药后的血药浓度非常低，几乎接近或低于实验中采用的HPLC法的检测限，使得浓度测定困难。因此在给药方案设计中，大鼠灌胃给药剂量为 10.0 mg/kg，是眼部给药的2倍。考虑到肝药酶可能会被饱和而使首过作用不明显，体内过程与实际情况相差较大，因此实验中未进一步增大灌胃给药剂量。

综上，NMD经眼部给药后可以提高生物利用度，能作为口服给药的替代途径，且预示其在临床上可能得到比口服更好的疗效，在治疗心脑血管疾病中有着广泛的临床应用前景。眼部给药是一种待开发的、有前途的给药途径，研究药物跨眼部屏障进入体循环，发挥全身治疗作用，具有较高的理论意义和实用价值，尤其对于急性疾病的治疗，以及一些用药剂量小、活性高的药物，其临床优势更加明显。研究显示，促渗剂的应用能够增加药物跨膜吸收来提高眼用制剂的生物利用度[16]，如冰片能改变血脑屏障、眼角膜、鼻腔黏膜及其他黏膜的结构，促进其他药物透过这些结构到达作用部位。刘煜德等[17]探讨了冰片对川芎嗪经鼻腔吸收入脑的影响，结果表明与川芎喷雾剂组比较，芎冰喷雾剂组川芎嗪更迅速进入脑组织并达到峰浓度，其峰值也高于前者，冰片提高了川芎嗪经鼻腔吸收入脑的速度，增加了脑组织中川芎嗪的吸收量。因此，我们将进一步探索促进剂对NMD经眼部给药后的体内过程的影响。