LC-ESI-MS/MS测定白酒中山梨糖醇的方法研究

余 义，刘 艳，周 玉

（黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉430050）

甜味剂是改善食品口味的一种食品添加剂，有着低热量、高甜度、糖尿病病人适用等特点而成为蔗糖替代品在食品中广泛使用。山梨糖醇呈甜性能：D-山梨糖醇有清凉的甜味，其甜度为蔗糖的50%～70%。1 g D-山梨糖醇在人体内产生16.7 kJ热量。食用后在血液内不转化为葡萄糖，也不受胰岛素影响，适合糖尿病人使用[1-4]。在食品工业中，可用作甜味剂、保湿剂、螯合剂和组织改良剂，可用于制作糕点，最大使用量为5.0 g/kg；在鱼糜及其制品中最大使用量为0.5 g/kg。还可作消泡剂，用于制糖工艺、酿造工艺和豆制品工艺，按生产需要适量使用[5-8]。

白酒是我国的传统蒸馏酒，按其风味特征可分为各种不同的香型，虽然每种香型各有其典型风格，但是不论哪种香型的白酒，保持适度的甜味，不仅可以遮盖其他一些苦涩杂味，而且还能使酒体甘洌、醇厚、绵软，但是这种甜味是来自于自然发酵产生的，而非添加甜味剂。风味化学研究表明，味觉是由一定的呈味物质引起的，酒之所以具有醇甜感，是因为酒中含有一定量的甜味物质，如高级醇、多元醇、氨基酸等，这些甜味物质，对于名优白酒，是由其特殊的生产工艺决定的，如浓香型大曲酒的低温入池、缓慢发酵，就是为了有利于醇甜物质的生成，无需另行添加[9-10]。

人工合成甜味剂可能对人体有致癌、致病的副作用[6]，因而已被许多国家限制使用。尤其在白酒行业，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760—2014中规定白酒中甜味剂不得检出。所以对于白酒中甜味剂的测定应该做到严格把关，防止行业和白酒企业中出现假冒伪劣产品，对消费者产生不利影响。目前，关于纽甜的检测方法主要有高效液相色谱-示差折光法[3]、高效液相色谱-蒸发光散射法[4]、液相色谱-质谱联用法[11-17]、高效液相色谱法[18-19]、离子交换色谱法[20]、毛细管电泳法[21]、气相色谱法[22]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

耗材及试剂：山梨糖醇（规格100 mg，储存温度-20℃，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Baker公司）；乙酸（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司，规格600 mL）。

仪器设备：Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷伦三重串联四级杆质谱仪(安捷伦科技有限公司）；Agilent ZORBAX RX-C18安捷伦色谱柱（4.6×250 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司）；有机滤膜(孔径0.22 μm，天津津腾)；全玻璃微孔过滤器(规格1000 mL，天津津腾实验设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取10 mg(精确至0.0001 mg)山梨糖醇标准品于100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的标准储备液，置于4℃冰箱中保存。根据使用需要用蒸馏水逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.2.2 样品前处理方法

用一次性注射器吸取均质样品，经0.22 μm的有机滤膜过滤，滤液供液相色谱-质谱联用仪测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX RX-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A为0.1%乙酸溶液，B为甲醇；流动相体积比：A∶B=20∶80；流速：0.4 mL/min；柱温箱：25 ℃；进样量：2 μL。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应检测模式；干燥气体温度：325℃；干燥气体流速：6 L/min；喷雾电压：206.8 kPa。

2 结果与分析

2.1 色谱条件和质谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

采取直接进样的方式，将目标物标准溶液注入质谱，分别进行正离子模式和负离子模式全扫描检测，得到一级质谱图和准分子离子峰，再用惰性气体氮气攻击该母离子，获得其二级质谱图及相应的子离子。结果表明，在负离子模式下响应值及灵敏度均高于正离子模式，因此，本方法选择负离子电离模式。利用多反应监测模式（MRM）对选定的定性离子和定量离子对碎裂电压、碰撞能、保留时间、碰撞池加速电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最佳。负离子模式下的质谱分析参数见表1。

表1 山梨糖醇的质谱参数

2.1.2 色谱条件的优化

分别以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸铵-乙腈等作为流动相进行样品分离。结果表明，用0.1%乙酸-甲醇作为流动相时物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性均优于0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸铵-甲醇，故本方法最终选用0.1%乙酸-甲醇为流动相进行洗脱。图1是山梨糖醇在优化的色谱和质谱条件下的MRM色谱图。

图1 山梨糖醇的多反应监测色谱图

2.2 线性范围、检出限和定量限

线性范围、检出限和定量限参照何红春等[3]的方法，将山梨糖醇标准储备液用蒸馏水稀释，分别配制成5种浓度为200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L、1600 μg/L、3200 μg/L的标准工作液，按1.2节所述的色谱-质谱条件进行测定，绘制标准工作曲线（图2）。

结果显示，在200～3200 μg/L的浓度范围内，所有分析物的质量浓度x(μg/mL)和响应值y之间线性相关系数为0.998；以性噪比为3确定检出限为40 μg/L，以性噪比为10确定定量限为200 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率参照马书民等[9]的方法，采用在空白样品中添加标准溶液的方法，选择常见的浓香型和兼香型白酒酒样及乙醇进行山梨糖醇检测试验，成品白酒1、白酒2的山梨糖醇含量均为未检出，并向样品中分别添加320 μg/L、1600 μg/L 两个浓度水平的山梨糖醇进行回收率实验，重复测定2次。共6组平行，12次检测，结果表明，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差小于5%，且回收率均在81%～105%范围内，所以该方法的精密度和回收率均符合相关标准要求。

2.4 与国标法比对

选择常见的4种不同类型白酒酒样添加山梨糖醇，将本方法与国标GB 1886.187—2016《食品安全国家标准食品添加剂山梨糖醇和山梨糖醇液》方法进行加标测回收率结果比对，比对结果见表2。

将本方法和国标方法的数据进行比较，两组数据的绝对偏差小于1，相对偏差小于10%。本方法的检出限是0.04 mg/L，定量限是0.20 mg/L。结果表明，本方法可以用于白酒中山梨糖醇的检测。相比液相色谱系统，液相质谱联用仪具有更高的分离度和灵敏度以及更短的检测时间。

图2 山梨糖醇的线性相关系数

表2 方法结果比对

3 结论

本研究利用液相色谱-质谱联用仪分析了白酒中甜味剂山梨糖醇化合物的分子信息，利用多反应监测模式的液相色谱-质谱联用仪技术，建立了一个快速、稳定、灵敏的可定性定量山梨糖醇的方法。该方法可在9 min内完成，其检测范围内线性良好（r=0.998）；本方法的检出限是0.04 mg/L，定量限是0.20 mg/L；精密度＜5%；回收率＞80%；且与国标中的检测方法相比检出限更低，能更加有效的监控白酒中山梨糖醇的含量，综上所述，该方法可以对山梨糖醇进行实际的定性定量检测。