酿酒酵母的筛选及发酵性能的比较

黄媛媛

(上海金枫酒业股份有限公司，上海201501)

黄酒是中国历史最悠久的酒种，是以稻米、黍米等为主要原料，经加曲（或部分酶制剂）、酵母等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒。在黄酒酿造中，酵母是主要发酵剂，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等，其发酵性能的优劣直接影响到黄酒的品质和出酒率[1-3]。目前国内酒厂主要使用购买的酒药或活性干酵母，或从黄酒发酵醪中分离筛选出性能优良的酿酒酵母。本研究从两种不同来源的黄酒发酵醪和活性干酵母中分离出15株酵母，通过TTC法和CO2失重法筛选出性能优良的3株酵母进行酿酒试验。对这3株酵母的产酒精能力、产酸能力以及发酵液中残余总糖、氨基酸态氮、挥发性风味物质等含量进行了综合比较[4-6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种、试剂

菌源来自本公司的黄酒发酵醪、绍兴某厂的黄酒发酵醪、安琪酵母股份有限公司的活性干酵母；试剂：无水酒精和NaCl为A.R.级，其余标样均为GC级。

1.1.2 培养基

麦芽汁培养基：麦芽汁，pH4.5，121℃灭菌20min。麦芽汁固体培养基：麦芽汁12～13°Bx，pH5.0～6.0，琼脂2.5%，121 ℃灭菌20 min。

TTC培养基：上层：2,3,5－三苯基氯化四氮唑0.05%，葡萄糖0.5%、琼脂1.5%、蒸馏水100%；下层：12～13°Bx的麦芽琼脂汁培养，121℃灭菌20min。

大米糖化液：大米100%，水300%，曲5%，50～60℃糖化3～4 h过滤即可得到糖度为18°Bx左右的大米糖化液，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

高压灭菌锅；恒温培养箱；超净台。

电位滴定仪785，Metrohm瑞士万通；酒精计，上海华辰医用仪表有限公司。

气相色谱仪为agilent6890N；色谱柱DB-WAX 30 m×0.32 mm×0.25 μm；顶空进样器HP-7694E。

1.3 试验方法

1.3.1 酿酒酵母的初筛

TTC筛选法：TTC与酵母菌的代谢产物发生显色反应，呈红色的菌落为产酒高的酿酒酵母，粉红色菌落次之，微红或白色菌落为野生酵母。

取安琪酵母1 g，在无菌条件下，加入麦芽汁液体培养基28℃培养24 h。然后取其培养液以及本公司、绍兴某厂的黄酒发酵醅各1 mL，在无菌条件下，逐级稀释涂布于麦芽汁平板培养基，每个稀释梯度平行做两个样，以28℃恒温培养48 h，待形成单个菌落时挑取其中的单个菌落划线分离，将纯菌种接种到试管斜面固体培养基并于4℃冰箱中保存。

将分离的斜面菌株一一对应涂布于TTC底层培养基上，并于28℃恒温箱中培养48 h左右。将温度已冷却为45～50℃的上层培养基倒在下层培养基上，于30℃无光条件下培养2～4 h后，取出立即观察颜色，根据菌落呈色情况挑选菌种。

1.3.2 酿酒酵母的复筛

CO2失重法：在500 mL角瓶中，装入400 mL 12～13°Bx的大米糖化液。灭菌冷却后，接入经24 h培养的液体菌种5 mL。称重记录原始重量，28℃培养，每隔24 h称重1次，及时了解发酵速度和失重情况，待发酵终止测总失重量，以及还原糖、酒精度、总酸、氨基酸态氮、pH值。检测方法参见国标GB/T 13662—2008。

1.3.3 发酵性能的比较

将复筛得到的酵母进行酿酒试验，对比3种不同来源的酵母的发酵性能。试验配方为：糯米15 kg、酒母1.2 kg、曲2.0 kg、水16 kg、α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶各3 mL。

1.4 分析方法

挥发性风味物质：采用毛细管气相色谱并结合自动静态顶空进样技术。

2 结果与讨论

2.1 初筛和复筛

经TTC法筛选出15株酵母菌株后，经CO2失重法复筛，并对其进行编号为J-1至J-5（源自本公司黄酒发酵醅），S-1至S-5（源自绍兴某厂的黄酒发酵醅），A-1至A-5（源自活性干酵母）。15株酵母菌的CO2总失重和发酵醪的理化指标结果见表l。由表1可看出，菌株J4、S1、A4产酒精能力较强，而且发酵醪的总酸和总糖含量也较低，说明这3株酵母的发酵能力较强。同时，这3种不同来源而筛选出的酵母发酵性能也不同，酵母J前48 h的CO2失重最多，说明起发速度快，不易染杂菌，总酸也较低；酵母S产酒精能力相对较弱，但产酸能力最强，平均为5.17 g/L；而酵母A产酒精能力最强，平均为12.2%vol，残余总糖也最低，平均为7.0 g/L，酵母发酵消耗糖生产酒精，残余总糖越低则酒精度相对越高。

2.2 发酵性能的比较

2.2.1 产酒精能力的比较

发酵过程中酒精度的变化结果见图1，结果表明：酵母J4起发速度最快，1 d时酒精度就能达到11.6%vol，产酒精能力最强，最终可达19.0%vol；而酵母A4次之，1 d时酒精度为10.7%vol，最终为18.9%vol；酵母S1最弱；1 d时酒精度为9.7%vol，最终为18.7%vol。

2.2.2 残余总糖的比较

发酵过程中残余总糖的变化结果见图2，结果表明，酵母A4、J4、S1糖利用率都较高，发酵液中的残余总糖都较低，分别为1.9 g/L、2.2 g/L、2.4 g/L，但是酵母S1糖利用的速度较慢。发酵液中的残余总糖反映酵母将糖转化成酒精的能力，如果初始糖含量相同，发酵结束后残糖量低，说明酵母对糖的转化利用率高，酒精度高，发酵能力强。

表1 15株酵母发酵醪失重及最后发酵醪理化指标结果

图1 产酒精能力的比较

图2 残余总糖的比较

2.2.3 产酸能力的比较

发酵过程中总酸的变化结果见图3，结果表明，酵母S1总酸最高，可达4.95 g/L，说明其产酸能力最强。酵母A4的总酸为4.77 g/L，酵母J4的总酸为4.50 g/L，产酸能力最弱。酸类物质是黄酒中重要的风味物质，在黄酒中有增加浓厚感和减少甜味的作用。所以总酸含量要适中，否则会影响黄酒的口感和风味。

图3 产酸能力的比较

2.2.4 氨基酸态氮含量的比较

黄酒中含有20多种氨基酸，大多具有酸、甜、苦、咸、鲜等味道，赋予黄酒丰富的味觉层次；能被酵母进一步代谢生成重要的风味物质高级醇，还能与糖发生美拉德反应，是黄酒色泽的重要来源[7-9]。发酵过程中氨基酸态氮的变化结果见图4，结果表明：酵母A4和J4的氨基酸态氮含量都较高，可达0.92 g/L，酵母S1的氨基酸态氮含量为0.75 g/L。

图4 氨基酸态氮含量的比较

2.3 挥发性风味物质的检测与分析

黄酒的挥发性风味物质由多种微量成分组合而成，包括醇、酯、醛、酸以及各种杂环类化合物等。酯类物质主要是乳酸乙酯、乙酸乙酯等，共同形成水果香气，对黄酒陈香有很好的衬托作用。醛类物质主要是乙醛以及乙醛和乙醇缩合而成的乙缩醛等，具有清醇的果香味，也就是黄酒的陈香气[10-11]。醇类物质主要是β-苯乙醇、异丁醇、异戊醇等，尤其是含量较高的β-苯乙醇，具有玫瑰花香、清甜蜜样的香气[12]。对3种酵母的发酵液进行了部分挥发性风味物质的检测，结果见表2。

表2 部分挥发性风味物质的检测结果 (mg/L)

根据上述检测结果，对酯类的总和、高级醇和β-苯乙醇做了进一步对比分析，如图5所示。酵母S1的高级醇含量最高，为347.9 mg/L，同时，总酯含量也最高，为46.5 mg/L。高级醇构成了黄酒特有的香气骨架，但是，据相关研究表明，黄酒中的高级醇含量远远大于其他酿造酒，而饮用黄酒引起上头的主要原因是黄酒中高含量的高级醇[13]。高级醇在黄酒中正常的生成和合理的存在对酒质呈香呈味有很好的积极作用，但若含量过高，会影响酒质并对人体产生危害，所以必须要严格控制高级醇的含量[14-15]。酵母A4的β-苯乙醇含量最高，为117.1 mg/L，同时高级醇含量最低，为310.4 mg/L。总酯和β-苯乙醇含量高对黄酒在后续陈酿过程的香气形成有较大贡献，使黄酒醇香浓郁。

图5 总酯、高级醇、β-苯乙醇含量的对比结果

3 结论

通过TTC法、CO2失重法、酿酒试验筛选出性能优良的3株酵母：S1、A4、J4，都具备发酵能力较强、性能稳定、产酸量适中等特点，符合酿造黄酒对优良酵母菌种的要求，可以用到黄酒生产中以提高黄酒的品质。其中从本公司发酵醪筛选出的酵母J4产酒精能力最强，从绍兴某酒厂发酵醪筛选出的酵母S1产酯能力最强，而从安琪公司的活性干酵母中筛选出的酵母A4产β-苯乙醇高、产高级醇低。3株酵母来源不同，各有特色，在黄酒生产中可以复合使用这3种酵母，以达到提高黄酒产量、质量和风味的目的，其复合添加比例以及生产工艺有待进一步研究。