达比加群在家兔中的药代动力学及其对实验室检查的影响

张培哲，曹邦明，李佳俊，张弛，夏明，杨向军

长期以来维生素K拮抗剂如华法林长期应用于口服抗凝治疗，但其治疗窗窄、受食物药物影响大、需定期检测及调整药物剂量、高出血风险等缺点和不足而限制临床应用[1]，甚至在治疗窗内仍有高达6%的严重出血事件发生[2]。近来新型口服抗凝药物克服以上不足成为抗凝治疗新选择，其中达比加群为合成的非肽类小分子、可逆性、特异性直接凝血酶抑制剂，能抑制游离型和与纤维蛋白单体结合的凝血酶的活性[3]，因此比华法林和低分子肝素更好的发挥抗凝效果。其前体药物达比加群酯无生物学活性，口服后经CES1和CES2两种酯酶水解后可迅速转化为有抗凝活性的达比加群[4]。RE-LY研究表明两种剂量的达比加群酯两天2次口服抗凝效果不劣于华法林且安全性更高，使更多的国家批准应用于临床的抗凝治疗[5]。目前达比加群的具体治疗窗尚未界定，且不良事件的发生与血药谷浓度相关[6]，比华法林有更高的胃肠道出血风险[2]，亦有其出血致死性事件的报道[7]，故仍需观察达比加群的药理学特性及通过实验室检查结果评估其抗凝作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1药品和试剂 达比加群酯胶囊150 mg(商品名为泰毕全，批号507056)购自勃林格殷格翰公司(德国)，部分凝血酶原时间(APTT)试剂(批号114873RE)、凝血酶时间(TT)试剂(批号114393)、STA-ECA主试剂(批号114814RE)及相关定标品(批号114288)和质控品(批号114289)均购自stago公司(法国)，达比加群(批号1-JYS-153-1)和达比加群-d3(批号2-NOT-148-1)均购自TRC公司(加拿大)，羧甲基纤维素钠，二甲基亚砜(DMSO)，乙酸铵、甲酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为市售分析纯。

1.1.2主要仪器 API 4000三重四极杆串联质谱仪(美国AB SCIEX公司)；1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；STA Compact System全自动血凝仪(法国stago公司)。

1.2实验方法

1.2.1实验动物及分组 18只雄性新西兰大白兔，普通级，体质量2.3～3.0 kg，均购自苏州大学实验动物中心(实验动物生产许可证SYXK(苏)2012-0062)，实验前均常规饲养1周。实验前禁食12 h，自由饮水。本研究中对于大白兔的处理符合动物伦理学标准。

1.2.2溶液配制 达比加群酯溶于0.4% DMSO和0.5% 羧甲基纤维素钠配制成悬浮液，每次实验前晚配制，4 ℃保存，现配现用。其他试剂配制参考各自说明书。

1.2.3实验过程及标本处理 将实验动物采用随机数字表法分为对照组、5 mg/kg组和10 mg/kg组，每组6只。5 mg/kg组和10 mg/kg组分别灌胃5 mg/kg和10 mg/kg的达比加群酯溶液，对照组灌胃等体积的溶剂，分别于给药前、给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h通过兔耳中央动脉采血2.7 mL，置于3.2%枸橼酸钠抗凝管中(1∶9)混匀后1 500×g离心20 min后取血浆分装立即冻存于-70 ℃直至检测。LC-MS/MS检测前室温溶解，其他实验室检查检测前均37 ℃孵育15 min。

1.2.4药代动力学检测 采用LC-MS/MS法检测达比加群药物浓度，最小检测浓度1 ng/mL。达比加群标准品用空白兔血浆配制成浓度范围为0～5 000 ng/mL的定标品，达比加群-d3(内标品)配制成100 ng/mL的溶液，检测过程参考Stangier等[8]方法并适量修改。取50 μL待检测标本或定标品加入50 μL内标物混匀后再加入20 μL的0.2 N NaOH 37 ℃孵育2 h，然后加入30 μL的0.2 N HCl和200 μL的甲醇充分混匀2 min后13 000×g离心10 min，取10 μL上清进行LC-MS/MS上机检测。色谱条件：色谱柱Venusil MP C18(2.1 mm×150 mm，5.0 μm)，流动相A液(5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸溶液)和流动相B液(乙腈-0.1%甲酸溶液)梯度洗脱：0～1 min，5% 流动B液；0～1 min，5% 流动B液；1～1.5 min，95% 流动B液；1.5～3.5 min，95% 流动B液；3.5～3.6 min，5% 流动B液，流速0.3 mL/min。质谱分析采用电喷雾离子化源正离子和多反应监测模式扫描，用于定量分析的离子对分别为达比加群m/z 472.0→289.0和达比加群-d3 m/z 475.6→292.2，总体分析时间5 min。

表1 各实验组的主要药代动力学参数

1.2.5实验室检查结果检测 采用STA Compact System全自动血凝仪检测APTT、TT及达比加群浓度[蛇静脉酶发色底物法(ECA)]，具体步骤参照各自说明书，每次检测前均做定标和质控。

2 结果

2.1药代动力学检测结果两实验组主要药代动力学参数见表1，平均药物浓度-时间曲线见图1。

图1 平均血药浓度-时间曲线

2.2各组TT比值随时间变化曲线与对照组相比，给药后TT-时间曲线随药-时曲线有类似的变化，提示达比加群在体内抗凝效果无时间延迟(图2)。

图2 TT随时间变化曲线

2.3实验室结果与LC-MS/MS相关性分析相关性分析提示APTT与LC-MS/MS检测的血药浓度呈低度相关(R2=0.224，图3)且高浓度时易超出仪器检测上限；TT与LC-MS/MS检测血药浓度呈高度相关(R2=0.780，图4)，低浓度时即显著延长；ECA检查结果与LC-MS/MS检测结果相关性分析提示两者呈高度相关(R2=0.882，图5)，但高浓度时(LC-MS/MS检测结果>300 ng/mL)无法得出ECA结果，Bland-Altman偏倚性分析图显示绝大多数ECA检查结果低于LC-MS/MS的检测结果(图6)。

图3 APTT与LC-MS/MS对应的散点图

图4 TT与LC-MS/MS对应的散点图

图5 ECA与LC-MS/MS对应的散点图

图6 Bland-Altman偏倚性分析图

3 讨论

达比加群为新型小分子非肽类可逆性直接凝血酶抑制剂，其药理学特征是可预测和可重复的，很少受食物药物影响且治疗窗广，无需常规监测药物浓度，但在临床中出现一些特殊情况如怀疑药物过量、急诊手术、致死性大出血等情况时，有效的实验室检查检测其抗凝效果仍十分必要[1，9]。而RE-LY研究表明口服达比加群酯的不良事件的发生与血药谷浓度相关[6，10]，故检测药物谷浓度可一定程度的避免不良事件的发生。

Stangier等[11]和Blech等[12]均指出与葡糖醛酸结合(结合型)的达比加群和游离型的达比加群有同样的药理学活性，也有研究指出对比游离型的达比加群，结合型的达比加群对APTT有类似的延长作用[13]，同时Stangier[14]亦指出达比加群的葡萄苷酸化并不影响其临床疗效，因此总体达比加群浓度可能更精确的反应体内的抗凝效果。本实验采用LC-MS/MS检测总达比加群的血药浓度，结果表明达比加群在新西兰大白兔中的药代动力学特性与其他动物和人相似[14-15]，提示达比加群在不同物种间有相似的药代动力学且是可预测的，这也为在新西兰大白兔模型中研究达比加群抗凝效果提供一定的理论依据。同时各组TT-时间曲线显示出与药-时曲线类似的趋势，提示达比加群的抗凝效果无时间延迟，这也与其他研究结果一致[11]。虽然LC-MS/MS为药物检测金标准[16]，但其仪器设备昂贵，操作及维修保养要求高，很难在大多数实验室普及[1]，故本研究同时采用ECA检测达比加群的血浆药物浓度[17]并探讨两者检测结果的相关性。研究表明ECA检测不受待检测血样中凝血酶原和纤维蛋白原含量的影响，利用ECA检测达比加群的血浆药物浓度可有效的排除凝血因子缺乏时的影响[18]。本实验相关性分析显示LC-MS/MS与ECA呈高度相关性，提示ECA可在一定程度上作为达比加群定量的指标，与Sinigoj等[10]和Hawes等[19]的研究结果一致，Bland-Altman偏倚性分析显示ECA低估药物浓度，与其他研究结果相符[17]，提示ECA不能反映总体的达比加群血药浓度，而Skeppholm 等[20]分别比较ECA与游离型和总体的达比加群血药浓度，得出ECA在人血浆中检测的为总达比加群血药浓度的结论，与本研究的结果不一致，这可能是由于种属间的差异及应用不同的定标品和质控品引起，目前尚缺乏相关的研究证实ECA反映哪一种达比加群血药浓度。

APTT与LC-MS/MS检测的血药浓度相关性分析提示两者有一定的敏感性，但相关性弱，且变异性大，正常范围的APTT值亦不能排除存在达比加群，因此其不适合作为定量检测达比加群的指标，但APTT的显著延长，甚至超过仪器检测上限，提示存在高血药浓度，而TT与达比加群浓度有很好的剂量相关性，低浓度的达比加群即引起TT显著延长，故在排除其他引起TT值延长的情况，TT可作为达比加群的定性指标，这也与其他研究结果相符[8，11]，虽然本研究TT值未超仪器检测上限，但以人为研究对象的研究中，TT在高浓度时易超出检测上限[21-22]，故结合临床实际，TT不适合作为达比加群定量的指标。

本实验对象为新西兰大白兔，考虑不同物种间可能存在差异，为此本实验APTT和TT均采用比值以减少实验误差，但不同实验室及不同检测试剂所测结果间存在较大差异[22]，应用本实验结果解释临床资料时需慎重。

综上所述，达比加群的药代动力学是可预测的且在体内抗凝效果无时间延迟；APTT不适合作为定量检测达比加群的指标，但其值显著升高提示高浓度的达比加群；TT可作为达比加群的定性指标；ECA可在一定程度上作为达比加群定量的指标，但需进一步的研究和探讨。