天然产物分离纯化新技术

王聪慧,任娜,魏微,赵卓,董岩

(北京联合大学 生物化学工程学院 食品科学与工程系,北京 100023)

天然产物是指从植物、动物体内提取的内源性的化学成分,包括黄酮类、有机酸类、酚类、蛋白质等对人体具有多种功效[1]。如花青素能够延缓衰老[2],绿原酸具有促进炎症愈合作用[3],白藜芦醇对人体心血管具有一定的保护作用[4]等,因此人们对天然产物的需求日益增长。但是由于天然产物含量较低、结构复杂、稳定性差等特点[5],它的分离纯化有一定的困难性。目前,常用的分离纯化方法主要有膜分离、吸附法、高速逆流色谱法等方法,本文综述了这几种方法在分离纯化天然产物中的应用。

1 膜分离

膜分离技术是一种物理分离过程,适合在常温下操作,所需能量低,产生废水少,分离过程简单高效,因此,它是分离热敏性物质的一种有效的方法,而很多天然产物都对温度敏感,故膜分离也应用于天然产物的分离纯化中。

Fadi Ali等[6]将电酸化分别和超滤/透滤(UF/DF)(pH=6)、UF/DF(pH=9)及等电沉淀法(pH=4.5)相结合制备大豆蛋白(SPI),并对制成的大豆提取物的组成和溶解度进行了比较,研究不同pH值的影响。结果表明,在pH=6时采用UF/DF,能够更有效地除去大豆蛋白中的矿物质,且大豆蛋白的溶解度与pH=4.5和pH=9时相比,分别提高了25%和60%。在pH为2～4.5之间,大豆蛋白的溶解度提高,而果汁等饮品的pH值恰好在3.5左右,因此,该提取物可作为果汁饮料或动力果汁配方的一种有价值的成分。

Zhao等[7]以玉米糠为原料,利用膜分离从它的生物碱水解物中分离阿魏酸。结果表明,在75 ℃时,将玉米糠在0.25%的氢氧化钠乙醇水溶液中溶解2 h,能够释放出81%的阿魏酸。溶解之后先超滤再纳滤,纳滤后直接结晶,可以很容易地将阿魏酸分离纯化出来。这种阿魏酸的分离技术要比离子交换层析简单得多,且产生的废水和有机溶剂较少。

Mei Yuh Chung等[8]通过超滤提取紫苏中的花青素。主要是通过分析膜分离过程中的溶质截留率和渗透通量,研究膜在截留花青素的同时能否让柠檬酸通过。采用10%柠檬酸溶液从紫苏叶中提取花青素,萃取物中的花青素可以通过超滤(UF)浓缩,超滤所用的膜截留量为6 000,这可能是由于形成了络合物。在UF操作中,增加跨膜压力或增加进料浓度导致溶质截留率增加,UF对花青素的回收率达到60%以上。

2 吸附法

吸附法主要利用具有吸附性能的材料对目的产物进行吸附,再使用其它试剂将其洗脱,从而得到纯度较高的分离物,是一种常用的分离方法。吸附法具有很多优点[9],如操作简单、高效节能,并且大多数情况吸附剂可再生循环利用等。到目前为止,常见的吸附剂有大孔树脂、分子印迹、炭材料、PVPP、介孔二氧化硅等。

2.1 大孔树脂

大孔树脂是一种聚合物,具有选择性良好、平均孔径大和机械强度高等特点,并且经济、环保、易于再生。因此,大孔树脂作为一种吸附剂在学术界的应用已非常普遍。

Sun等[10]利用大孔树脂ADS-21从向日葵的叶子中分离纯化绿原酸(3-CQA)。结果表明,ADS-21能够很好的吸附/解吸3-CQA。在25 ℃时,使用ADS-21树脂对3-CQA的吸附过程很好地符合Langmuir等温吸附和准二级动力学模型。利用ADS-21进行吸附后,产物中3-CQA的含量增加了5.42倍,从12.0%增加到65.2%,回收率为89.4%。

Liu等[11]对比研究了24种不同类型的大孔树脂对番茄皮中的番茄红素的吸附性能。结果显示,相比其它树脂,LX-68树脂具有更高的分离效率。LX-68树脂对番茄红素的静态吸附实验符合Langmuir等温吸附和准二阶动力学方程。将LX-68树脂对番茄红素的动态吸附/解吸实验进行优化,得到最佳分离条件如下：45 ℃时,采用样品浓度、体积和流速分别为16.3 mg/L、500 mL和20 BV/h；洗脱时,先采用100 mL 95%的乙醇,之后用100 mL乙酯-乙醇(30∶70,v/v),当流速达到20 BV/h时,换为100 mL流速为30 BV/h的乙酯-乙醇(70∶30,v/v),温度与吸附过程相同。经过动态分离纯化,得到的番茄红素含量增加了30.4倍,从0.21%增加到6.38%,回收率为66.9%。

2.2 分子印迹技术

分子印迹聚合物是一种对目的物能够进行特异性选择识别的物质。由于这些聚合物材料在设计分子选择性、耐久性和可再生性等方面具有优势,在科学界引起了越来越多的关注。

Lachlan J Schwarz等[4]采用分子印迹固相萃取(MISPE)技术从花生压榨废液中分离(E)-白藜芦醇。结果显示,印迹分子MIPres对溶解在有机溶剂中的(E)-白藜芦醇具有较好的吸附能力,且能在水溶液中条件下清除花生压榨废液中的其他成分。因此,只需少量样品,MIPres就能够从含有生物活性多酚(包括(E)-白藜芦醇和儿茶素)的花生压榨废液中有效地提取(E)-白藜芦醇。

段玉清等[12]通过制备白藜芦醇纳米二氧化硅表面分子印迹聚合物(MIPs-Res)对白藜芦醇进行吸附。结果显示,与化学组成相同的非印迹聚合物相比,MIPs-Res对白藜芦醇的选择性和吸附性更高,最大吸附量为11.20 mg/g,能够在3 h内达到吸附平衡。

2.3 多孔炭材料

常见的多孔炭材料主要有活性炭、碳纳米管、中孔炭等。

2.3.1 活性炭 活性炭具有多孔结构,比表面积大,能够吸附分子化合物,因此,它在食品工业及制造业中经常作为一种吸附剂来使用。

Ou等[13]研究了粉末活性炭和颗粒活性炭分离纯化阿魏酸的区别,结果表明,在极低浓度下,粉末活性炭能够更有效地吸附阿魏酸并进行回收,且用0.2 mol/L的NaOH溶液能够将吸附的阿魏酸完全洗脱。因此,在甘蔗渣的碱水解产物中,即使阿魏酸浓度较低,也可用粉末活性炭对阿魏酸进行回收。

Mirna Leonor’Sua rez-Quiroz等[14]用80 ℃热水、70%甲醇溶液(v/v)和60%异丙醇溶液(v/v)3种试剂提取绿原酸,并结合活性炭纯化方法进行分离试验。结果表明,使用80 ℃水提取结合活性炭进行纯化,产生的污染小,且提取率高(5.07±1.0)%,与有机溶剂提取和活性炭纯化的结果相比,两者无显著差异。但是,使用热水不仅能够有效避免有机溶剂所产生的污染,并且更加省时省力,因此,可以用热水代替有机溶剂。

2.3.2 碳纳米管 碳纳米管是一种新型炭材料,物理化学性质稳定、孔隙结构多、比表面积较大,因此常用来作为吸附药物、染料大分子、农药等的吸附剂。Niu等[15]研究了碳纳米管固相萃取三组高极性化合物(即头孢菌素类抗生素、磺胺类药物和酚类化合物)的能力。结果表明,对于高极性化合物,碳纳米管的提取效果明显优于C18。将碳纳米管和石墨化碳黑的吸附能力对比,发现前者对于头孢菌素类抗生素和磺胺类药物的吸附能力更强,但后者对一些酚类化合物的吸附能力更高。使用碳纳米管在最优条件下对样品进行回收,其中,磺胺噻唑和磺胺嘧啶的回收率分别在55%～79%和72%～92%,磺胺吡啶和磺胺嘧啶的回收率均在85%～102%。

2.3.3 中孔炭 中孔炭除了具有炭材料的一般优点外,还具有孔径较大、中孔孔容较大等优点,广泛地被应用于分离纯化等。

张川等[16]采用廉价的水玻璃为原料来制备中孔炭,之后对制备的中孔炭吸附性能进行研究。结果表明,制成的中孔炭微球的平衡吸附量远超一般的吸附材料,能够达到606 mg/g。在研究中孔炭微球的孔径和孔容对VB12吸附的影响时发现,当孔径逐渐减小或孔容逐步增大时,平衡吸附量增大；但温度对VB12吸附的影响则呈现钟形,即随着吸附温度逐渐升高,平衡吸附量先增加后减小。中孔炭微球对VB12的吸附吻合Langmuir等温吸附和准二级动力学模型。

我们实验室的孙慧等[17]利用中孔炭纯化葡萄叶中提取的白藜芦醇。结果发现,在50 ℃条件下,用40%乙醇萃取30 min,可得到最大白藜芦醇含量。纯化时,先用中孔炭进行吸附,再用70%乙醇洗脱,得到的白藜芦醇纯度从2.1%提高到20.6%,且杂质含量最低,抗氧化活性最高。

2.4 PVPP

PVPP,全称交联聚乙烯吡咯烷酮,也是一种吸附材料。

LenaJankowiak等[18]研究了pH值在4～7的情况下,PVPP对豆渣提取物中异黄酮的吸附。结果表明,通常情况下,PVPP对于大豆异黄酮的亲和力要比对甘油三酯的亲和力高出10倍左右,但随着pH值的降低,PVPP对甘油三酯的亲和力略有提高,但大豆异黄酮并无显著性变化。而PVPP在中性pH时对异黄酮的亲和力最高。由于部分异黄酮与蛋白质相结合,提取物中含有大量的蛋白质,在pH较低的情况下,蛋白质会发生沉淀导致异黄酮的损失,故没有使用PVPP的情况下,约有3%～25%的蛋白质会损失。因此,利用PVPP进行吸附的时候,不同pH条件下会影响对产物的吸附性能会有影响,故需注意控制pH值。

Couteau D等[19]对酶解后的甜菜渣中的阿魏酸进行分离纯化。结果表明,颗粒活性炭(GAC)、XAD-16和PVPP在动态吸附时对阿魏酸的最大吸附量(w∶w阿魏酸/吸附剂)分别为22%,12%和8%。实验时发现,洗脱液的pH值是决定吸附效率的关键因素。在相同pH值条件下,颗粒活性炭对阿魏酸的亲和力最高,其次是XAD-16和PVPP。

2.5 介孔二氧化硅

介孔二氧化硅是一种多孔材料。

Yoshiumi Kohno等[20]研究了天然花青素染料在介孔二氧化硅上的吸附,以及吸附后花青素的稳定性。结果表明,含微量铝的HMS型介孔氧化硅可以成功吸附花青素,利用正丙基对二氧化硅疏水表面进行改性,提高了吸附在孔中的花青素的含量和稳定性。

2.6 壳聚糖微球

壳聚糖又称脱乙酰甲壳素,是一种天然多糖,不仅具有良好的降解性能,且能够抑制细菌生长,还具有来源丰富、价格低廉、环保等优点,可作为生物吸附剂,通过氢键或离子交换相互作用吸附各种有机酸。

Liu等[21]研究了以壳聚糖微球为吸附剂,分离经泡沫分离和酸性水解后产生的大豆乳清废水中的异黄酮苷元。结果表明,异黄酮苷元在壳聚糖微球上的吸附是一个自发放热的物理过程,符合准二阶模型,吸附等温线适合用Freundlich方程来描述。在pH=6时可以获得最大的平衡吸附容量。以70%乙醇为解吸溶液,总异黄酮苷元最大解吸率可达94.82%。此外,再生的壳聚糖微球可以重复使用,在不影响其功能的情况下,可连续使用5次。

3 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法(HSCCC)与传统的色谱分析有一定的区别,但由于分离时间短,能够有效避免因发生化学反应而使产物变性的优势。

Yang等[22]分别采用氯仿甲醇水溶液、氯仿甲醇正丁醇水溶液和甲基叔丁醚-四氢呋喃-0.5%三氟乙酸水溶液从大豆粗提物中分离异黄酮。结果表明,各分离组分的纯度均达到98%～99%。利用氯仿甲醇正丁醇水溶液提取的大豆粗提物500 mg,经高效液相色谱法分离,得到约100 mg的大豆苷,纯度超过98.5%；得到4种极性异黄酮5～10 mg,纯度在98%～99%之间。由此可见,高速逆流色谱法是一种高效的分离纯化方法,可应用于大分子分离等。但是采用此种方法分离成本较高,且只适用于少量产物的分离,因此该方法的应用并不广泛。

4 结束语

本文综述了膜分离、吸附法(大孔树脂、分子印迹、炭材料等)、高速逆流色谱等方法对天然产物的分离纯化。其中,膜分离是一种新兴的技术,最初是应用在大分子活性物质的分离中,但是已有研究者慢慢将其应用到小分子物质的分离纯化中；大孔树脂是一种常见的吸附材料,因其容易获得、成本低、选择性较好等优点,常被用来分离活性物质等,但分离过程中可能存在有机溶剂污染、产生大量的废液等缺点；炭材料也是一种常用的分离方法,由于其具有很高的比表面积、孔隙较大,从而能够通过吸附对天然产物进行分离纯化,与此分离机理类似的还有介孔二氧化硅、PVPP、壳聚糖等；高速逆流色谱是一种色谱方法,能够减少产物与空气的接触时间,分离纯度较高,但是分离量不够大、成本高。

因此,在未来对天然产物的分离纯化中,若是能够处理好成本、环保、分离性能之间的关系,且能够大规模进行分离纯化,以上天然产物的分离纯化方法将具有开拓性的进展。