白藜芦醇抑制血管紧张素Ⅱ/TLR4/NF-KB调控鼠血管平滑肌细胞炎症和氧化应激损伤作用

梁冬冬，刘少奎，高新宇，王筱梅，王翠荣

动脉粥样硬化（AS）是造成脑梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）等的主要原因，其主要取决于血管内膜病变及受累器官的缺血程度，其中氧化应激损伤是动脉粥样硬化和支架内再狭窄形成的重要机制[1,2]。在氧化应激环境下，血管中层的平滑肌细胞的病理性增殖和氧化应激的损伤，使平滑肌细胞的过度增殖、迁移以及细胞外基质的大量蓄积，最终加速促进动脉粥样硬化的发展过程[3,4]。血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要因子，是由血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转化酶的作用下，水解产生的多肽物质[5]。血管紧张素受体存在于人体的肾上腺皮质球状带细胞、血管平滑肌、及心脏等器官的细胞上。Ang Ⅱ通过与血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应，包括①使全身静脉和微动脉收缩，增加回心血量；②促使交感缩血管中枢处于紧张状态；③促进交感缩血管纤维递质释放，增加其释放量；④渴觉激发或增强[6,7]。因此，抑制血管紧张素转换酶的活性可有效减少血管紧张素Ⅱ生成，起到促进血管舒张的作用。白藜芦醇（Res）是多酚类化合物，在多种植物，如葡萄、花生等中较为常见，研究发现，白藜芦醇除了具有抗炎、抗衰老、抗氧化应激、抗肿瘤等作用之外，还可以通过抑制血管平滑肌细胞的增殖发挥心血管保护作用[8,9]。本研究主要通过以大鼠血管平滑肌细胞为研究对象，观察白藜芦醇是否可抑制Ang Ⅱ/TLR4/NF-KB信号通路，来缓解大鼠血管平滑肌细胞的炎症和氧化应激损伤作用，为白藜芦醇在心血管病变的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞大鼠胸主动脉平滑肌A7r5细胞株，购自武汉典型生物保藏中心。

1.2 CCK-8法检测A7r5细胞存活率大鼠胸主动脉平滑肌A7r5细胞株用1640培养基培养后，分为对照组、RES组（30 μmol/L）、AngⅡ组（10-4μmol/L）和实验组（30 μmol/L RES预处理2 h+10-4μmol/L AngⅡ），按上述条件培养A7r5细胞株48h，接种于96孔板中，将培养基更换，再加入CCK8试剂（10 μl），37℃下孵育2 h，在450 nm波长处用酶标仪测定其OD值，从而得到A7r5细胞存活率的结果。

1.3 ELISA检测炎症因子含量变化按上述条件培养48h后收集A7r5细胞培养上清液，离心14 min（4 ℃，3000 r/min），吸取上清液。采用ELISA法检测TNF-α和IL-6。

1.4 试剂盒检测细胞氧化应激指标改变细胞爬片后，分别给予空白对照、RES组（30 μmol/L）、AngⅡ组（10-4μmol/L）和实验组（30 μmol/L RES预处理2 h+10-4μmol/L AngⅡ），按上述条件培养48 h，采用试剂盒检测ROS，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内ROS改变。

按上述条件培养48 h后收集A7r5细胞培养上清液，采用试剂盒检测细胞上清液中iNOS活性。

1.5 WesternBlot检测蛋白表达水平按上述条件培养48 h后收集A7r5细胞，提取蛋白并检测蛋白浓度，对蛋白样品（总量20 μg/μl）进行电泳，转膜，AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白抗体孵育，二抗孵育，DAB显色，计算AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白表达量。

1.6 统计学处理数据处理均采用SPSS 22.0软件进行，行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料，计量资料结果用均数±标准差（±s）表示，组间差异采用单因素方差分析和t检验。计数资料采用例数（%）表示，组间差异采用卡方检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

图1 A7r5细胞存活率

2.1 CCK-8法检测A7r5细胞存活率与对照组相比，AngⅡ组A7r5细胞株存活率升高，RES组和实验组A7r5细胞株存活率降低（P＜0.05）。与AngⅡ组相比，RES组和实验组A7r5细胞株存活率降低，实验组A7r5细胞株存活率下降更为明显（P＜0.05）（图1）。

2.2 ELISA法检测TNF-α和IL-6表达变化与对照组相比，AngⅡ组A7r5细胞株TNF-α和IL-6表达升高，RES组和实验组TNF-α和IL-6表达降低（P＜0.05）。与AngⅡ组相比，RES组和实验组A7r5细胞株TNF-α和IL-6表达降低，RES组A7r5细胞株TNF-α和IL-6表达下降更为明显（P＜0.05）（表1）。

2.3 细胞氧化应激指标ROS和iNOS活性改变与对照组相比，AngⅡ组A7r5细胞株ROS和iNOS活性升高，RES组和实验组ROS和iNOS活性降低（P＜0.05）。与AngⅡ组相比，RES组和实验组A7r5细胞株ROS和iNOS活性降低，RES组A7r5细胞株ROS和iNOS活性下降更为明显（P＜0.05）（图2～3）。

2.4 WesternBlot检测蛋白表达水平与对照组比较，AngⅡ组A7r5细胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量升高，RES组和实验组AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量降低（P＜0.05）。与AngⅡ组相比，RES组和实验组A7r5细胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量降低，RES组A7r5细胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量下降更为明显（P＜0.05）（图4）。

表1 ELISA法检测TNF-α和IL-6表达变化结果

图2 ROS活性改变

图3 iNOS活性改变情况

图4 WesternBlot蛋白表达含量

3 讨论

白藜芦醇（RES）又称为芪三酚，对患者和机体无任何毒副性作用，具有抗肿瘤和抑制机体炎症反应等作用，对心脑血管疾病具有预防和治疗作用[10,11]。近年来研究证实，白黎芦醇通过调节多条细胞内信号转导通路，调节心肌平滑肌细胞的增殖和凋亡，抑制和缓解动脉粥样硬化的形成过程[12,13]。

研究表明[14]：机体内的各种生物因子之间存在紧密的联系，且能相互作用、相互制约，从而处于动态平衡状态。大鼠血管平滑肌A7r5细胞给予AngⅡ处理后，A7r5细胞存活率升高，炎症因子TNF-α和IL-6表达及氧化应激指标ROS和iNOS活性升高，说明AngⅡ可有效刺激氧化应激炎症反应，促进大鼠血管平滑肌细胞异常增殖，最终引起血管壁的病理改变，加速动脉粥样硬化斑块的形成进程。有文献表明[15]，白藜芦醇可通过减少ROS生成以及降低动脉平滑肌细胞凋亡率来对抗H2O2诱导的动脉平滑肌细胞氧化损伤，这与本研究中氧化应激指标ROS的变化相一致。与其他三组相比，RES组A7r5细胞株ROS和iNOS活性下降更为明显（P＜0.05），藜芦醇可以抑制ROS活性，降低一氧化氮合酶产生，并且减轻炎症反应。此外，文献报道[16]，白藜芦醇可通过调节STAT3以及STAT3相关的信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖。本研究中，给予白藜芦醇干预AngⅡ的效果后，与AngⅡ组相比，RES组和实验组A7r5细胞株存活率降低，但均显著高于对照组，且实验组A7r5细胞株存活率下降更为明显（P＜0.05），说明白藜芦醇可抑制异常血管平滑肌细胞的增殖。从本研究结果看出：白藜芦醇是通过抑制ROS活性、降低一氧化氮合酶产生，以及减轻炎症反应的途径来实现抑制异常血管平滑肌细胞的增殖。

TLR4信号通路可激活NF-κB，从而刺激机体释放炎症因子[14]。NF-κB在静息状态下与其抑制性蛋白（IκB）结合，IκB 激酶（ IKK）复合体诱导 IκB 磷酸化，NF-κB 逐渐活化并向细胞核移位，调控炎症因子的释放。研究发现，白藜芦醇可能在一定程度上通过TLR4通路抑制TLR4蛋白表达对心肌细胞发挥保护作用[17,18]。白藜芦醇还可以通过调节NF-κB通路，抑制炎症反应，发挥保护作用[19]。本研究结果表明，给予白藜芦醇干预AngⅡ的效果后，RES组和实验组鼠血管平滑肌A7r5细胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量显著降低，并且RES组鼠血管平滑肌A7r5细胞株AngⅡ、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白含量下降更为明显（P＜0.05）。其机制主要是由于一方面，RES 能下调由AngII诱导大鼠血管平滑肌细胞 TLR4、TLR4、P-P65，P-IKB蛋白水平的表达；另一方面，RES 能抑制 NF-κB p65入核，减少炎症因子TNF-α和IL-6的释放[20-22]。

综上所述，白藜芦醇可有效缓解大鼠血管平滑肌细胞的炎症和氧化应激损伤，主要通过抑制血管紧张素Ⅱ/TLR4/NF-KB信号通路，从而发挥对血管平滑肌细胞的保护作用。