RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在2型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用

黄柳，贾妍，郭炳彦，刘素云，李拥军

2型糖尿病（T2DM）是一种最常见的糖尿病，约占90%以上[1]。糖尿病心肌病（DCM）是T2DM的一种慢性并发症，临床主要表现为心功能异常，最终可发展为心力衰竭、心源性休克甚至死亡，其发病机制目前尚不明确[2]。自噬是一种细胞应激和自我防御的机制，可以与溶酶体融合为自噬溶酶体，降解细胞内退化的细胞器、异常蛋白质等结构，维持细胞内环境的稳定[3]。近年来研究显示[4]，自噬参与了T2DM患者的心肌细胞代谢紊乱、心肌纤维化等病理生理过程，与DCM的发生密切相关。Rho激酶（ROCK）是RhoA下游重要的效应分子，在细胞自噬过程中发挥极为重要的作用[5]。研究发现[6]，RhoA的异常表达可导致心血管重塑、心力衰竭，在DCM的发生发展中具有重要作用，但其作用具体机制尚不清楚。本研究探讨RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在糖尿病心肌纤维化中的作用，旨在为临床诊治DCM的治疗和预防提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与动物多功能酶标检测仪（iMark680）购自Bio-Rad公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司；盐酸法舒地尔注射液购自天津红日药业有限公司，国药准字H20040356；3-甲基腺嘌呤（3-MA）自噬抑制剂、0.2%胶原酶Ⅱ购自美国Sigma公司；RT-PCR检测试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；无支原体胎牛血清、DMEM培养液购自北京索莱宝科技有限公司；Ⅰ型前胶原（PCⅠ）和PCⅢ ELISA检测试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；Vimentin、肌球蛋白磷酸酶靶向蛋白1（M Y P T 1）、p-MYPT1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、UNC-51样激酶1（ULK1）、p-ULK1单克隆抗体，均购于美国Santa Cruz公司；β-actin和辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG，购于DAKO公司。

SPF级SD雄性大鼠60只，体重均为180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2015-0001，饲养于本院动物中心实验室，保持室温恒定为25℃，模拟昼夜，自由摄食与饮水。

1.2 动物造模及给药60只大鼠预饲养一周后，将其随机分为对照组、模型组、法舒地尔组、3-MA组和法舒地尔+3-MA组各12只。除对照组外，所有大鼠均采用高脂饮食法联合小剂量链脲佐菌素诱导T2DM大鼠模型[7]，饲喂高脂高糖饲料，连续喂养4周后，对DM组大鼠进行单次腹腔注射STZ（40 mg/kg），对照组大鼠饲喂普通饲料，注射等体积枸橼酸盐缓冲液，若72 h后造模大鼠血糖≥16.7 mmol/L，说明建模成功，造模过程中共2只大鼠死亡[6]。造模后，法舒地尔组和法舒地尔+3-MA组大鼠腹腔注射法舒地尔（10 mg/kg/d，分两次注射）；3-MA组和法舒地尔+3-MA组大鼠腹腔注射自噬抑制剂3-MA（15 mg/kg/d），法舒地尔+3-MA组两次注射时间间隔1 h；模型组和对照组注射等体积生理盐水，连续4周。治疗后处死大鼠，取大鼠心脏，称重并计算心脏肥厚指数，将左心室组织进行光镜观察。

1.3 HE染色观察大鼠心肌组织病理学取大鼠左心室组织，采用4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、包埋和切片及HE染色，在光镜下观察组织的病理变化，每张切片随机取5个视野拍照。

1.4 RT-PCR检测大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ、PCⅢ mRNA的表达取大鼠左心室组织，匀浆，采用Trziol裂解液提取总RNA，经紫外分光光度计确定其浓度，采用RT-PCR进行反转录合成cDNA，参考已有文献，设计引物、反应条件、反应体系。进行RT-PCR，以GAPDH为内参，进行半定量分析。

1.5 Western Blot检测心肌组织MYPT1、p-MYPT1、LC3-I、 LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、p-ULK1、ULK1的表达取大鼠左心室组织，匀浆，使用细胞裂解提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，取50 ng总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜，室温密封2 h，采用洗膜缓冲液洗膜并加一抗4℃孵育过夜，洗膜加二抗室温孵育2 h。再用ECL化学发光显示，收集影像，选用β-actin作为内参，采用凝胶图象处理系统分析对比条带强弱。

1.6 大鼠心肌成纤维细胞的分离与鉴定参考已有文献进行大鼠心肌成纤维细胞分离与鉴定[8]。取大鼠左心室组织，采用0.2%胶原酶Ⅱ反复吹打混匀，于37℃、200 r/min的摇床上消化60 min，加入等体积含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止，离心（1000 rpm，5 min），弃上清，重复3次，加10 ml含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养箱差速贴壁60～90 min，贴壁的细胞为心肌成纤维细胞，每隔1 d换液。取2代的心肌原代成纤维细胞以105个接种于放有无菌盖玻片的6孔板，4%多聚甲醛固定30 min，加入0.2% TritonX-100室温封闭20 min，200 μl非免疫动物血清室温封闭30 min，滴加兔抗大鼠Vimentin一抗（1：100稀释），4℃过夜，然后 TRITC标记的二抗 200 μl（1：100稀释），避光孵育1.5 h，DAPI染核后甘油封片，在荧光显微镜下观察。

1.7 MTT法检测大鼠心肌成纤维细胞的增殖取原代培养的原代成纤维细胞，采用常规胰酶消化，制成细胞悬液，调整浓度为2.0×104个/ml，每孔加入100 μl，37℃、5% CO2培养箱中培养。分别于0 h、24 h、48 h和72 h进行细胞增殖检测，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），培养4 h，采用酶标仪检测波长为490 nm处各孔的吸光度值。

1.8 大鼠心肌成纤维细胞内PCⅠ、PCⅢ含量取原代培养的心肌成纤维细胞，胰酶消化后，收集上清液，采用ELISA法测定心肌成纤维细胞培养PCⅠ和PCⅢ水平，严格按照说明书操作；采用RT-PCR检测成纤维细胞内PCⅠ和PCⅢ水平。

1.9 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，对计量资料先行正态性检验，各组均满足正态性且两组间方差齐，采用单因素方差分析比较组间差异性，若组间比较有差异，采用SNK-q比较差异性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理变化HE染色结果显示，对照组大鼠心肌组织细胞结构完整，排列整齐；模型组、3-MA组和法舒地尔+3-MA组大鼠心肌组织细胞排列紊乱，心肌纤维断裂，伴随大量炎性细胞浸润；法舒地尔组大鼠心肌组织细胞较整齐，伴随少量炎性细胞浸润。与对照组相比，模型组大鼠心脏肥厚指数明显增加（P＜0.05）；与模型组相比，法舒地尔组大鼠心脏肥厚指数明显降低（P＜0.05）；与法舒地尔组相比，法舒地尔+3-MA组大鼠心脏肥厚指数明显增加（P＜0.05）（图1，表1）。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化（×200倍）

2.2 各组大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表达与对照组相比，模型组大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表达均明显上调（P均＜0.05）；与模型组相比，法舒地尔组大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表达均明显下调（P均＜0.05），3-MA组大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表达均明显上调（P均＜0.05）；与法舒地尔组相比，法舒地尔+3-MA组大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表达均明显上调（P均＜0.05）（表2）。

2.3 各组大鼠心肌组织MYPT1、p-MYPT1、LC3-Ⅰ、 LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、p-ULK1蛋白的表达与对照组相比，模型组大鼠心肌组织p-MYPT1/MYPT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1、p62、p-ULK1/ULK1的表达均明显上调（P均＜0.05）；与模型组相比，法舒地尔组大鼠心肌组织p-MYPT1/MYPT1和p62的表达均明显下调（P均＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表达均明显上调（P均＜0.05），3-MA组大鼠心肌组织p-MYPT1/MYPT1的表达均明显上调（P均＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表达均明显下调（P均＜0.05）；与法舒地尔组相比，法舒地尔+3-MA组大鼠心肌组织p-MYPT1/MYPT1和p62的表达均明显上调（P均＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表达均明显下调（P＜0.05）（图2，表3）。

2.4 各组大鼠心肌成纤维细胞的分离鉴定免疫荧光染色显示，各组大鼠心肌成纤维细胞Vimentin抗原免疫荧光呈阳性反应，表明实验分离细胞为高纯度成纤维细胞（图3）。

2.5 各组大鼠心肌成纤维细胞的增殖情况MTT结果显示，与对照组相比，模型组大鼠心肌成纤维细胞的增殖活性明显增加（P＜0.05）；与模型组相比，法舒地尔组大鼠心肌成纤维细胞的增殖活性明显降低（P＜0.05），3-MA组大鼠心肌成纤维细胞的增殖活性明显增加（P＜0.05）；与法舒地尔组相比，法舒地尔+3-MA组大鼠心肌成纤维细胞的增殖活性明显增加（P＜0.05）（表4）。

2.6 各组大鼠心肌成纤维细胞内PCⅠ和PCⅢ含量与对照组相比，模型组大鼠心肌成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显增加（P均＜0.05）；与模型组相比，法舒地尔组大鼠心肌成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显下降（P均＜0.05），3-MA组大鼠心肌成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显升高（P均＜0.05）；与法舒地尔组相比，法舒地尔+3-MA组大鼠心肌成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明显增加（P均＜0.05）（表5）。

3 讨论

表1 各组大鼠的心脏肥厚指数

DCM主要是由于心脏组织的胶原沉积引起，近年来研究显示[11]，DCM的发生发展与细胞内自噬障碍有关，减弱的自噬可以加快DCM的恶性发展。RhoA是一种自噬相关蛋白，可以激活下游的ROCK，调控自噬障碍，法舒地尔是RhoA的选择性抑制剂，可以作用于ROCK的激酶区域ATP结合位点上，保护心肌细胞损伤[12]。3-MA是目前最常用的一种自噬抑制剂，因此，本研究采用法舒地尔和3-MA来研究RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在T2DM心肌纤维化中的作用。本研究中，3-MA作用后T2DM大鼠的心肌组织病理变化明显加重，心脏肥厚指数明显增加，法舒地尔可以明显减轻T2DM大鼠的心肌组织病变，降低心脏肥厚指数，提示RhoA激酶信号通路被抑制后，可以促进自噬的过程，减轻T2DM大鼠的心肌组织病变。研究显示[13]，糖尿病患者的高血糖可以破坏心肌细胞线粒体膜的完整性，引起心肌细胞能量代谢障碍，出现心肌肥大，导致心室结构和功能的变化。邱轩等[14]研究显示，T2DM大鼠心肌组织中RhoA的表达水平与心脏肥厚指数均呈正相关，提示RhoA激酶信号通路可能通过抑制自噬过程，增加心脏肥厚指数，加重心肌组织损伤。

表2 各组大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表达

图1 各组大鼠心肌组织病理变化（×200倍）

图2 各组大鼠心肌成纤维细胞的分离鉴定（×200倍）

表3 各组大鼠心肌组织p-MYPT1/MYPT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1、p62、p-ULK1/ULK1蛋白的表达

表4 各组大鼠心肌成纤维细胞的增殖情况

表5 各组大鼠心肌成纤维细胞PCⅠ和PCⅢ水平

本研究中，T2DM大鼠体内的ROCK1和ROCK2水平明显上调，MYPT-1的磷酸化水平明显上调。MYPT-1是ROCK作用的主要靶蛋白之一，其磷酸化水平反应了ROCK的活性[15]，提示T2DM大鼠体内的ROCK激酶被激活，参与调控DCM的发生发展。本研究中T2DM大鼠体内的LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin 1、p62、p-ULK1水平明显上调。ULK1是自噬启动和进展的关键调控因子，磷酸化的ULK1可以激活Beclin1，激活自噬过程[16]。LC3是一种典型的自噬体标志蛋白，在自噬状态下，LC3-I会转变为一种膜结合形式即LC3-II，临床常用LC3-II/LC3-I比值来衡量自噬活性，提示T2DM大鼠体内存在异常增强的自噬活性[17]。p62是自噬的特异性降解底物，可以与LC3结合，并通过自噬降解，一般情况下，其表达水平与机体的自噬活性呈反比[18]，提示T2DM大鼠体内的自噬流受损，存在清除障碍。刘婷婷等[19]研究显示，自噬流受损与DCM的发生发展密切相关，心肌细胞的自噬对于维持心脏功能和活性具有重要作用。本研究中，法舒地尔干预可降低MYPT-1的磷酸化，下调ROCK1、ROCK2、p62的表达，上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1、p-ULK1的表达，提示法舒地尔可抑制RhoA激酶信号通路，抑制ROCK的活性，修复受损的自噬流，保护心肌组织损伤。叶红伟等[20]研究显示，法舒地尔可抑制RhoA激酶信号通路，修复自噬过程，保护缺血再灌注大鼠的心肌组织损伤，与本研究相符，提示RhoA激酶信号通路介导的自噬障碍在T2DM大鼠心肌组织损伤中有重要作用。

临床研究显示[21]，心肌纤维化是心肌成纤维细胞过度增殖，引起Ⅰ型和Ⅲ型胶原过度沉积的一种病理过程。本研究中，T2DM大鼠的心肌成纤维细胞的增殖活性明显增加，自噬抑制剂3-MA可以进一步促进其增殖活性，而法舒地尔可以抑制T2DM大鼠成纤维细胞的增殖活性，提示法舒地尔可以抑制RhoA激酶信号通路，修复自噬过程，抑制成纤维细胞的增殖活性。本研究中，T2DM大鼠的心肌组织和成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原的水平均明显升高，法舒地尔可以降低T2DM大鼠的Ⅰ型和Ⅲ型前胶原的水平。Ⅰ型和Ⅲ型胶原主要由成纤维细胞分泌，是细胞外基质的重要组成成分。Tao等[22]研究显示，DCM大鼠体内的高糖环境可以刺激心肌成纤维细胞的过度增殖，促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积，诱导心肌纤维化的产生，提示法舒地尔可以抑制RhoA激酶信号通路，抑制成纤维细胞的增殖及胶原沉积，从而抑制T2DM大鼠的心肌纤维化。

综上所述，法舒地尔可以抑制RhoA激酶信号通路，促进自噬的修复，抑制成纤维细胞的增殖以及胶原沉积，降低心脏肥厚指数，抑制T2DM大鼠的心肌纤维化，为法舒地尔的应用提供了理论依据。