钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ与心律失常的研究进展∗

范稣圳 徐林 浦湧

在多种心脏疾病中,离子通道的功能紊乱和细胞内钙转运调节异常可引起心律失常和心肌收缩功能障碍。既往生理学研究表明,钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent kinaseⅡ,CaMKⅡ)是调节心肌细胞Na＋、K＋、Ca2＋等离子通道活性和钙转运的重要激酶。诸如心肌缺血-再灌注损伤、急性心肌梗死(AMI)、心房颤动(简称房颤)、慢性心力衰竭(简称心衰)等疾病都涉及CaMKⅡ的过度激活及下游蛋白的功能异常。因此,调节CaMKⅡ活性可能会成为心律失常预防和治疗的重要措施。笔者对近期有关CaMKⅡ信号通路的研究进行综述。

1 CaMKⅡ的结构和特点

1.1 CaMKⅡ的结构

CaMKⅡ是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,有α、β、γ、δ四种基因表型,CaMKⅡδ是心脏主要表型。CaMKⅡ分子由6～12个多聚体亚单位组成,形成齿轮状结构。每个CaMKⅡ亚单位包含3个不同的单元域,即羧基端结合域、包含自我抑制位点和钙调蛋白(calmodulin,Ca M)结合位点的中间调节域、氨基端催化域。

1.2 CaMKⅡ的激活

目前已发现心肌细胞中CaMKⅡ存在四种激活途径,如图1,现分述如下。

图1 CaMKⅡ的4条激活途径

1.2.1 CaMKⅡ的Ca2＋-Ca M依赖性激活 心肌收缩期时,胞内Ca2＋增多,形成Ca2＋-Ca M的复合物同CaMKⅡ的调节域结合,调节域T206/207对催化域的自我抑制消除,激活该酶。当三磷酸腺苷(ATP)或Mg2＋存在时,细胞内Ca2＋-Ca M的浓度持续升高会使自抑区Thr286/287自磷酸化,称为自磷酸化激活,同时也使Ca M与CaMKⅡ的亲和力极大增加,称为“Ca M捕获(Ca M trapping)”。生理条件下,Ca M与CaMKⅡ解离后,自我调节域T305/306被磷酸化,防止Ca M的再次结合和CaMKⅡ被过度激活。

1.2.2 CaMKⅡ的氧化激活 在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激下,胞内活性氧自由基(ROS)升高时,ROS通过氧化调节域上的蛋氨酸残基Met281/282,激活CaMKⅡ,称为氧化激活。CaMKⅡ氧化激活也需要起始的Ca2＋-CaM结合启动,但与自磷酸化激活不同,蛋氨酸残基氧化会阻止“Ca M捕获”。Yao等[1]观察到ROS产物增多会使得INa-L增加、胞内钠超载和钙超载从而间接激活CaMKⅡ。Kohlhaas等[2]还发现线粒体ROS合成系统会受胞内钠浓度升高的刺激而激活,ROS对CaMKⅡ的激活效应通过这一途径被放大,提示病理条件下的CaMKⅡ的氧化激活可能会形成正反馈的环路。

1.2.3 CaMKⅡ的糖化激活 研究[3]表明,CaMKⅡ被Ca2＋-Ca M始动激活后,葡萄糖与尿苷二磷酸(UDP)经氧-氮乙酰葡萄糖胺转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase,OGT)生成的氧-氮乙酰葡萄糖胺(O-GLc NAc)作用于CaMKⅡ调节域上的S279/280位点,启动CaMKⅡ自主活性,这种O-GLc NAc调节的CaMKⅡ激活可以诱导肌浆网Ca2＋渗漏,干扰离子通道功能,可引起糖尿病性心脏病和心律失常。

1.2.4 CaMKⅡ的一氧化氮激活 晚近研究[4]发现,心肌细胞β-受体(β-AR)兴奋后,会激活蛋白激酶B(PKB),PKB激活一氧化氮合酶(NOS)产生NO,NO则作用于CaMKⅡ调节域上的硝基化位点,启动CaMKⅡ活性并导致肌浆网Ca2＋渗漏,进而诱发心律失常。研究表明,异丙肾上腺素(ISO)诱导的肌浆网钙渗漏能被NOS抑制剂L-NAME阻断,NOS基因敲除小鼠在ISO刺激下没有出现钙渗漏的增加。

2 CaMKⅡ与离子通道和钙转运

触发激动是继动作电位(AP)上升支后的膜电位震荡,其不能自发的独立产生,总是依赖于正常除极后发生,因此称为后除极。后除极包括早后除极(EAD)和延迟后除极(DAD)。EAD发生在AP的2相或3相,DAD发生在复极化完成或接近完成时。后除极只要达到阈电位,就可激活内向电流,产生一次新的兴奋,新的自发性AP是触发激动的结果。CaMKⅡ可以通过改变离子通道或钙转运相关蛋白的活性,诱发EAD或DAD,继而触发心律失常。

2.1 CaMKⅡ对离子通道的调控

2.1.1 CaMKⅡ对钠通道的调控 CaMKⅡ可磷酸化Nav1.5晚钠电流(INa-L)通道,增加细胞内Na＋浓度,造成胞内钠超载,直接引起EAD。除此之外,过高的胞内Na＋浓度可能会激活Na＋-Ca2＋交换体(Na＋-Ca2＋exchanger,NCX)的反向转运将Ca2＋运入胞内,间接造成细胞内钙超载[5],通过影响钙触发的钙释放(CICR),导致DAD和心律失常的发生[6－7]。Wanger等[6]和Sag等[8]观察到CaMKⅡδc过表达转基因(TG)小鼠心肌细胞出现INa-L的增高,AP时程的延长和EAD的增多。

2.1.2 CaMKⅡ对钾通道的调控CaMKⅡ对电压门控K＋通道Kv1、Kv2、Kv3、Kv4和Kv7(h ERG)、KCNQ1也有调节作用。CaMKⅡ可以直接磷酸化Kv4.3 Ser-550位点,减慢通道失活,并加速其复活,上调Ito峰值,缩短AP的时程[9]。CaMKⅡ能磷酸化KCNQ1延迟整流钾通道T482/S484位点,下调Iks,增加AP时程[10]。心衰时,常出现CaMKⅡ-KCNQ1的过度磷酸化,AP时程的延长,从而诱发心律失常。

2.1.3 CaMKⅡ对钙通道的调控 CaMKⅡ可以激活转录因子NFκB下调电压门控钙通道(L-type calcium channel,LTCC)α亚单位(Cav1.2)表达,CaMKⅡ还可以直接磷酸化LTCC,总效应表现为增加心肌细胞的Ca2＋内流[11],称钙电流(ICa)易化作用。病理状态下,CaMKⅡ过度激活时,LTCC失活减慢,ICa峰值增加,并影响CICR和心肌细胞的收缩功能。ICa的增加也增加内向INCX,诱发EAD,引起心律失常[12]。

2.2 CaMKⅡ与钙转运

心室收缩期,CaMKⅡ磷酸化肌浆网(SR)上的兰尼碱受体(RyR2)S2814位点,激活RyR2,使SR钙库中的Ca2＋大量释放至胞质中。心室肌舒张期,大部分的Ca2＋由SR钙泵(sarcoplasmic reticulum Ca2＋-ATPase,SERCA2a)重回收至SR,少部分由NCX转运至胞外。受磷蛋白(PLN)是SERCA2a活性的负性调控蛋白,CaMKⅡ可通过对磷酸化PLN的T17位点,解除PLN对钙泵的抑制,恢复钙泵的活性,从而Ca2＋的重回收。CaMKⅡ过度激活使舒张期RyR2过磷酸化造成的Ca2＋外流至胞质称钙渗漏,过高的Ca2＋激活NCX,产生的瞬时内向电流(transient inward current,ITI),诱发DAD。Maier等[13]和Zhang等[14]观察到CaMKⅡδc过表达TG小鼠心肌细胞在ISO的诱导下,钙渗漏引发的DAD较对照组多,异常节律增加。

3 CaMKⅡ在不同病理生理条件下的致心律失常机制

3.1 CaMKⅡ与AMI及再灌注损伤

恶性心律失常是AMI病人的主要死因之一。由于AMI患者的心肌缺血缺氧,糖酵解使胞内H＋、Na＋、Ca2＋浓度相继异常增加,CaMKⅡ被过度激活[15]。缺血缺氧时及酸性环境下,SERCA2a和RyR2也出现功能障碍。但当再灌注后,由于ATP合成的恢复,SERCA2a和Ry R2过度激活,Ca2＋迅速进入SR,造成SR钙超载和舒张期钙渗漏,并会激活NCX诱发DAD,进而导致室性心动过速和心室颤动。

3.2 CaMKⅡ与心衰

在心衰的病理过程中,CaMKⅡ过表达和活性增高常诱发严重的心律失常和收缩功能障碍。Luo、Andrson[16]和Zhang等[17]的研究证实,由于心衰CaMKⅡ过表达,PLN T17磷酸化的增多,调节SERCA2a活性的作用减弱。同时由于SERCA2a表达的减少,SERCA2a与PLN的比例失调,钙泵功能严重受损,使得心衰患者CaMKⅡ-RyR过度激活引起的钙渗漏不能通过SERCA2a回收,诱发心律失常。Toischer等[18]观察到主动脉缩窄(TAC)法心衰模型小鼠,CaMKⅡT287自磷酸化水平增高和活性的增强,使Nav1.5通道过磷酸化并增加INa-L,使得AP时程延长并易诱发EAD。

3.3 CaMKⅡ与房颤

CaMKⅡ所造成的钙渗漏是房颤的病理过程之一。Yan等[19]观察到老龄C57B/6J小鼠的心房肌细胞c-Jun氨基末端激酶-2(c-Jun N-terminal kinase,JNK2)活性明显增强,而JNK2能增加CaMKⅡ的磷酸化激活,增加房颤的发生。Voigt等[20]收集慢性房颤病人的右房标本后发现,患者相比于正常窦性心律的人表现出CaMKⅡT287自磷酸化和RyR2 S2814磷酸化的增加。

房颤还通过CaMKⅡ增强INa-L,进而通过增强CaMKⅡ氧化激活,加重钙渗漏。Onal等[21]等应用计算机模拟人心房肌细胞AP进行实验表明,持续的CaMKⅡ过度激活和INa-L的增强会影响胞内钙稳态的平衡,诱发后除极。Neef等[22]研究发现,慢性房颤相比于窦性心律,会有钙渗漏的明显增强。因此,CaMKⅡ引起的钙渗漏、增强INa-L是房颤发生的机制之一。

4 CaMKⅡ的抑制剂

CaMKⅡ与多种疾病合并出现的心律失常密切相关,亦有实验表明使用CaMKⅡ抑制剂下调CaMKⅡ活性能减少心律失常的发生。目前常用的CaMKⅡ的抑制剂有化学合成的竞争性抑制剂和合成肽类抑制剂。研究表明,CaMKⅡ抑制剂能减少心肌缺血-再灌注损伤相关病理改变及心衰模型动物或人心脏细胞异常节律的发生,减少房颤的发作。

4.1 化学合成的竞争性CaMKⅡ抑制剂

化学合成的竞争性抑制剂包括KN-93/KN-62,其中KN-93在实验中应用较多。KN-93不仅能和Ca2＋/Ca M结合位点结合,竞争性抑制CaMKⅡ活性,还能直接抑制LTCC、IKr通道和电压门控K＋通道,AMI患者心律失常与心肌细胞酸中毒密切相关,Pedersen等[23]进行小鼠实验,KN-93能减少心肌细胞酸中毒后室性心动过速的发生。Yan等[19]观察到KN-93以及JNK抑制剂JNK2I-IX能阻断老龄房颤小鼠JNK-CaMKⅡ信号通路的过度激活,减少房颤的发作。Neef等[22]研究发现慢性房颤患者心房细胞的钙渗漏能被KN-93所抑制。

但KN-93尚不能口服给药,且KN-93的阻断作用不具有特异性,而带来较多的副作用。Warren等[24]应用光学成像技术观察到,KN-93对左右室缺血心肌细胞的效应存在差异,会降低右室流出道细胞的传导性,具有一定的致心律失常性。Bell等[25]观察到离体大鼠心脏在复流后给予KN-93会出现心肌收缩力的减弱和缓慢型心律失常。

4.2 合成肽类CaMKⅡ抑制剂

AIP(autocamtide-2 inhibitor proteins)和AC3-I(autocamtide-3 inhibitor)是人工合成的多肽,为基于底物的CaMKⅡ抑制剂,其对CaMKⅡ的抑制作用不受Ca2＋-Ca M的影响,即对钙依赖的或非钙依赖途径均有抑制作用。Toischer等[18]研究发现AIP能减弱主动脉缩窄法(TAC)心衰模型小鼠INa-L、AP时程和钙渗漏,减少DAD。Yan等[19]观察到AIP能减少老龄房颤小鼠JNK-CaMKⅡ过度激活,减少房颤的发作。然而,AIP在体内易被降解,且AIP不能口服给药,这给其临床应用带来一定的局限性。

4.3 新型CaMKⅡ抑制剂

SMP-114(Rimacalib)为异恶唑(isoxazol)衍生物,是一种已进入二期临床试验的抗风湿药。AS105是一种嘧啶衍生物。Rimacalib和AS105能与ATP竞争同CaMKⅡ的结合,抑制CaMKⅡ的自磷酸化激活,在一定程度上也能起到抑制CaMKⅡ的作用[26]。Neef等[27－28]观察到SMP-114和AS105能减少小鼠心室肌细胞和人心房细胞钙火花的频次,增加SR回收Ca2＋的能力,减少致心律失常性钙渗漏。

4.4 其他对CaMKⅡ活性有影响的药物

由于CaMKⅡ能被NOS氧化激活后,激活下游Nav1.5通道,INa-L的增加,胞内钠超载又会增加NOS生成,形成正反馈环路。Viatchenko-Karpinski等[29]用兔分离的心室肌细胞实验,INa-L抑制剂雷诺嗪能中止这一环路,降低舒张期Ca2＋浓度,减少舒张期钙渗漏和心律失常。

5 小结

综上所述,CaMKⅡ介导的Ry R2过磷酸化导致的钙渗漏和INa-L过度增强在AMI、心衰合并心律失常以及房颤的发病中非常重要。已有很多的关于CaMKⅡ及其抑制剂的动物实验和研究来证明抑制CaMKⅡ活性能中止心律失常的发作。但由于传统CaMKⅡ抑制剂如KN-93、AIP、AC3-I的临床应用存在很大的局限性,因此有必要对SMP-114、AS105等新型CaMKⅡ抑制剂进行进一步研究,以期发现其在心律失常防治中能起到的重要作用。