烯醇化酶在模式生物中的功能研究进展

黄宇菲

（清华大学附属中学，北京 100084）

糖酵解是指在无氧条件下，葡萄糖进行分解并转化为丙酮酸的过程。烯醇化酶（Enolase，ENO，2-phospho-D-glycerate hydrolyase）作为糖酵解过程中的一个限速酶，催化2-磷酸-D-甘油酸（2-PGA）与高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的相互转化，控制糖分分解进行的速率，是糖酵解过程中唯一的脱水步骤。

在脊椎动物中，烯醇化酶有三种同工酶，分别是α-ENO、β-ENO和γ-ENO，定位于不同位点的烯醇化酶有不同的功能。α-ENO由基因ENO1进行编码，ENO1是一种具有多功能的糖酵解酶，它不仅可调控生物体的生长、发育与繁殖，还可参与细胞应激，对癌症的发生和转移存在影响。ENO1可与c-myc（myc癌基因家族中的重要基因）的启动子结合，起到抑制肿瘤生长的作用。同时也有研究表明，ENO1在拟南芥植株根系及角果中表达量很高，而在茎及叶中表达量相对较低。

糖酵解过程中酶对植物的生长发育起到不可或缺的作用。近几年来，ENO2在模式植物中也有诸多研究。ENO2突变缺失体的植株内部细胞缩小，并有严重的细胞分化缺陷，导致植株木质化受限，从表型来看，ENO2缺失的植株主要表现为叶发黄且小、莲座叶少、根短、主茎短、花粉发育不正常等。水稻与拟南芥的调控机理很相似，ENO2在水稻中通过调控RFT1基因的表达，控制水稻的抽穗期，在长日照的条件下，过表达ENO2的水稻植株抽穗期将推迟。

糖酵解作为生命活动能量的主要来源，承担着许多重要的角色。ENO2作为调控基因，参与弓形虫细胞内繁殖的过程，现已有研究成功克隆出弓形虫内的ENO2，为相关疫苗及诊断提供了线索。在日本血吸虫中同样也发现了烯醇化酶的表达，并有相关研究对其进行了克隆、定位及生物学初步研究。研究探索烯醇化酶在猪带绦虫中的生物学功能，实验发现所克隆的ENO具有特异结合性及酶活力，由此据此推测猪带绦虫的ENO可能在寄生虫入侵宿主过程中起到作用。

本综述将就如上几个方面，对近年来ENO在模式生物内的研究展开介绍与总结。其中将着重介绍ENO2在几种重要模式植物体内的调控机制、相关功能及研究进展。

1 烯醇化酶在拟南芥中的功能作用

烯醇化酶有三个同工酶，分别为ENO1、ENO2以及ENO3，它们在氨基酸水平上具有56-68%的相似性。在拟南芥中，只有ENO1、ENO2表达的烯醇化酶具有活性。ENO1的表达位置在质体，ENO2主要是在细胞质及细胞核中发挥作用，ENO2是LOS2位点编码的一种蛋白。近几年来，关于烯醇化酶在植物中表达及其功能的研究越来越多。烯醇化酶不仅在细胞糖酵解过程中起到限速作用，在植物生长发育过程中也起到影响，对于各种激素及环境胁迫也可做出响应，ENO2的表达量最多，起主要的催化作用。

1.1 烯醇化酶2对拟南芥生长发育的功能作用

野生型和ENO2突变体植株在幼苗时期生长发育无明显差异，在萌发后8～10d突变体植株出现明显发育缺陷，主要特征为ENO2突变体茎直径严重减小，下胚轴直径明显减小，叶子尺寸减小，植株叶面和表皮呈萎黄、网状化状态。花和芽较小，且花不具有发育功能，花药严重受损，角果形态小，果中没有种子。通过显微镜可观察到植株表皮下胚轴细胞直径明显缩小、叶表皮路面细胞尺寸、毛状体及基底细胞大小减小，血管组织成分有严重缺陷。通过研究拟南芥中芥子酸苹果酸酯及苯丙酸木质素的含量，发现芥子酸苹果酸酯含量显着降低，得知烯醇化酶的活性影响芥子酸苹果酸酯及木质素的表达量，从而对植物体的正常生长发育产生影响。

ENO2还参与植物生长素的分泌过程。研究培养拟南芥的生长素突变体，并将植株与ENO2突变体进行比较，发现三种幼苗根部的生长均受到抑制，由此表明ENO2可能会在植物生长素的分泌过程中发挥作用，并使植株根部的生长发育产生缺陷。对拟南芥植株体内的烯醇化酶进行反义抑制，降低其95%的活性，抑制酶活性后丙酮酸含量未减少，2-磷酸甘油酸酯的含量基本上保持不变，但植株内部游离氨基酸的含量升高，磷酸烯醇式丙酮酸盐的含量显著降低，因而抑制植株叶面的代谢速率。实验说明ENO2的表达会降低植物进行呼吸作用的速率，影响植株进行次级代谢。植株的生理功能虽然没有产生大的改变，但生长发育过程中受到一定的限制。

1.2 烯醇化酶2对拟南芥响应胁迫的功能作用

施加一定量浓度的ABA后，低浓度的盐溶液对拟南芥的生长发育并未产生影响，说明可以相应盐胁迫的机制。使用300mmol/L的Nacl溶液对拟南芥进行盐胁迫，并通过RT-qPCR分析拟南芥植株中ENO2的转录水平，实验结果显示，拟南芥的ENO2T-DNA插入突变体对盐胁迫十分敏感，经胁迫后的拟南芥体内ENO2转录水平迅速升高。在盐处理后，突变体拟南芥更易死亡，实验阐明ENO2对盐的抗性机制，反应了ENO2基因可响应高盐胁迫的功能特点，拟南芥ENO2基因可响应低温胁迫，AtENO2基因通过负调控影响STZ/ZAT10的表达，增强拟南芥植株的耐寒性。

另一方面，重力的改变可影响植物体内部的代谢反应。将拟南芥的愈伤组织细胞培养物暴露于超重力环境下模拟失重，发现愈伤组织细胞中烯醇化酶的磷酸化程度显著降低。烯醇化酶一般通过脱磷酸作用进行表达，磷酸化程度的降低代表其活性在超重力处理下显著提高，说明ENO2可对超重力环境的改变做出应答反应。

2 烯醇化酶在协助病原生物侵染宿主的研究进展

2.1 烯醇化酶在弓形虫中的研究进展

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种可广泛寄生在动物体细胞内部的原虫，人和动物被侵染后易患弓形虫病。弓形虫病在全世界感染普遍，感染后可致使人体免疫力下降，引起脑部、眼部等诸多部位病症。烯醇化酶不仅在动植物体内糖酵解过程中起到限速作用，更参与细胞的转录、分化、凋亡等过程，核酸序列和氨基酸序列具有高度的保守性，它们以阶段特异性的方式差异表达，同时在酶学动力学方面还是具有一定的差异。弓形虫中烯醇化酶enolase1（TgENO1）存在于缓殖子阶段，enolase2（TgENO2）存在速殖子阶段，TgENO1和TgENO2均已定位于寄生细胞核，并受到不同热应激启动子元件的调控。弓形虫烯醇化酶在寄生虫发育阶段具有重要的核功能。

近来发现烯醇化酶也能定位在细胞膜和细胞核表面，有的能分泌到细胞外。David等发现刚地弓形虫烯醇化酶能够特异性的定位在胞核中，弓形虫胞内发育增殖的早期高效表达，核质染色深且致密，当发育到成熟阶段，烯醇化酶的表达水平开始下降，核质染色变浅，表明该酶的表达量与细胞核的活跃程度具有紧密联系，由此推测烯醇化酶在虫体发育增殖过程中具有基因调控作用。

烯醇化酶在病原体生物表面被发现，证实了烯醇化酶在病原生物侵染寄主过程中起到重要作用。在脊椎动物中，病原体表面的烯醇化酶可与动物细胞膜上的血纤维溶酶原相结合，操控细胞的溶迁系统，进行侵染、转移和扩散。

2.2 烯醇化酶在绦虫中的研究进展

不同生长阶段的绦虫使用荧光定量PCR技术检测烯醇化酶基因的表达量，发现烯醇化酶在虫体的不同发育阶段mRNA含量有显著差异，基因的表达量与虫体生命活动的旺盛程度呈正相关，这说明了烯醇化酶的含量会影响到绦虫虫体能量的供应，从而影响其生理活动。寄生虫的烯醇化酶具有较强的免疫原性，对绦虫经行免疫性特异分析，发现绦虫体内的烯醇化酶可以在侵入人体后对宿主的免疫应答产生刺激。烯醇化酶还可以在寄生侵入过程中与寄主的胞质素及细胞壁相结合，说明烯醇化酶在绦虫入侵宿主的生命活动中起到重要作用。

2.3 烯醇化酶在小鼠中的研究进展

脑部及肌肉是小鼠体内最活跃的部位，当这两个部位处于病理状态时，α-烯醇化酶会适应性地调节细胞的产能过程，以满足细胞在不同状态下的需求。当心肌肌肉供能不足时，小鼠机体调动肌糖原，提高糖类物质转化的效率，增加糖酵解以维持机体的正常生理活动，这时α-烯醇化酶的表达量会有所升高。Bryer等研究证实，在肌肉组织重塑过程中，ENOl是作为主要的纤溶酶原受体，在心肌创伤后愈合以及心肌梗塞时，包括ENOl在内的纤溶过程在心肌组织修复和再生过程中发挥了要调控作用。另外，ENO1可以通过影响小鼠体内糖酵解及三羧酸循环等步骤，影响ATP的合成，这对肿瘤的形成和发育是非常重要的。在肿瘤形成的早期，ENO1发挥抑制肿瘤形成的功能，在癌症发展期间，肿瘤细胞表面ENO1表达上调，促进肿瘤的侵袭。

寒冷的环境可以改变生物体内的稳定状态。在低温环境下，小鼠肝脏活动增强，通过增加产热来抵御寒冷，心脏功能则暂时减退。对小鼠进行冷应激后，发现冷应激组小鼠肝脏内ENO1基因mRNA转录水平与对照组相比显著提高，心脏内则显著降低。说明在冷应激时，小鼠机体调节ENO1的表达量，提高肝脏代谢，降低心脏活动，从而调节机体平衡。

3 结语

大量的研究表明，烯醇化酶在不同模式生物中都有表达，如：拟南芥、果蝇、小鼠、线虫等。烯醇化酶在不同的模式生物中都起着重要的作用，其中ENO2在拟南芥中主要通过糖酵解途径影响其生理状态，缺乏ENO2的植株通常呈现发育不良的表型，繁殖也会受到一定的影响。ENO1对于肿瘤的发展过程具有抑制和促进的双重作用。在肿瘤生长早期，ENO1可抑制肿瘤侵袭，而在肿瘤发展过程中，ENO1可加快肿瘤的生长扩散。在病原生物表面的烯醇化酶可以调控溶纤系统，帮助寄生生物入侵和感染。目前，已有研究发现绦虫体内的烯醇化酶可以对宿主的免疫系统产生刺激。说明烯醇化酶具有很好的疫苗应用前景，但对于烯醇化酶调节机体免疫的机制尚不明确，有待进一步研究。