黄芪对高血压大鼠血管重构中内质网应激反应的影响

顾静，郭超，车敏，吴红彦，李海龙

(甘肃中医药大学, 兰州 730000)

高血压病因机制复杂交错，血管重构参与其发生发展。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，对细胞具有双向调节作用，早期适度的 ERS 可诱导 ER 分子伴侣如钙网蛋白(calreticulin，CRT)等的表达上调,促进ER功能的恢复[1]，具有细胞保护作用。随着时间的延长，过强的ERS通过诱导凋亡相关分子caspase-12等的活化而导致细胞凋亡[2-3]。已有的报道指出，ERS参与了动脉粥样硬化性心脏病、收缩性心力衰竭、糖尿病以及阿尔茨海默症等多种疾病的发生发展[4]，但在高血压的发展中ERS对血管重构的影响鲜有报道。黄芪具有强心、抗氧化[5]、抗炎、双向调节血压、减弱损伤引起的ERS反应[6]等作用，但调节血压保护高血压血管的分子机制还不清楚。本研究拟构建高血压模型，检测 ERS分子在血压发展的不同时期的表达情况，并以中药黄芪干预，探讨高血压血管组织中ERS及黄芪调节血压、改善血管损害的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠140只，体重(200 ± 10)g，来源于甘肃中医药大学科研实验动物中心【SCXK(甘)2011-0001】。实验在甘肃中医药大学科研实验动物中心进行【SYXK(甘)2013-0001】。

1.1.2 试剂与仪器

黄芪注射液(AST)购自正大青春宝药业有限公司(批号：1405232)；大鼠GAPDH、CRT和caspase-12等抗体购自于Santa Cruz公司；TUNEL 荧光检测凋亡试剂盒、RIPA裂解液等购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腹主动脉狭窄术建立高血压大鼠模型[4,7]

肋弓下缘 0.5 cm、腹正中线旁左侧 0.5 cm 处行 2.0 ～ 2.5 cm 纵行切口，分离组织入腹腔，在腹主动脉与左侧肾动脉交汇处的上方，用0 号手术线将腹主动脉和七号针头一起结扎[4], 缓慢抽离针头缝合伤口并消毒。假手术组仅分离出腹主动脉。术后肌注头孢预防感染。

1.2.2 动物分组及给药

实验动物分为空白对照组、高血压模型组、干预组(手术联合黄芪组)，按术后时间分为 1、2、4、6周四个亚组。术后第2天开始，干预组大鼠腹腔注射AST 8 g/(kg·d)，换算成体积为0.8 mL/d，对照组与模型组等体积生理盐水腹腔注射，连续42 d。

1.2.3 鼠尾动脉测压法[8]测量大鼠血压及动脉血管标本的采集

术前1 d和术后1、2、4、6周对大鼠进行尾动脉血压测定，测3次，取平均值[4]。然后麻醉大鼠，开胸沿心脏分离出主动脉备用。

1.2.4 病理切片及免疫组化

HE染色，显微镜(×400)观察血管壁中层平滑肌层的结构变化。免疫组化染色，图像分析系统分析并计算平均光密度。

1.2.5 血管肌层厚度的测量

从每个亚组随机选取8张切片，在每张切片显微镜下随机选3个视野，利用图像分析系统对选取的视野进行分析测量，对测得的主动脉血管壁肌层厚度值取平均值[4]。

1.2.6 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)凋亡检测

TUNEL 法检测细胞凋亡。

1.2.7 Western blot

裂解液提取总蛋白，变性、定量，凝胶电泳，转膜，封闭，加一、二抗孵育；曝光显色及图像分析。由凝胶成像系统采集信号并利用图像分析软件分析目标蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

图2 大鼠腹主动脉形态变化(HE)Figure 2 Morphological changes of abdominal aorta in the rats(HE staining. Scale bar=20 μm)

2 结果

2.1 大鼠血压变化

模型组术前与对照组无差异，但术后1、2、4、6周对比对照组血压分别升高12.7%、17.4%、30.8%和34.3%(均P< 0.05)，且有递增趋势(见图1)。

术后1、2、4、6周干预组对比相应的模型组血压分别降低了8.4%、2.4%、8.7%和18.9%(均P< 0.05)(见图1)。6周时干预组降压幅度最大。

注：与对照组比较，*P< 0.05，**P<0.01；与模型组比较，+P< 0.05，++P< 0.01。图1 大鼠血压的变化Note.*P< 0.05， vs. the control group.**P<0.01， vs. the control group. +P< 0.05, vs. the model group.++P< 0.01, vs. the model group.Figure 1 Changes of blood pressure in the rats

2.2 大鼠腹主动脉形态学变化

空白对照组中膜肌层VSMC扁平、胞质丰富、层次清楚、内膜较完整(图2A)；模型组中早期(2周)中膜肌层VSMC肥大、细胞排列紊乱，细胞较疏松，弹性膜弯曲、紊乱(图2B)，后期(6周)VSMC核淡染、排列紊乱、结构不清，血管壁表现为形态学重构(图2C)；而AST干预组(6周) VSMC核增多、深染，此外平滑肌束增宽、层次清楚，血管壁的重构程度减轻(图2D)。

2.3 大鼠主动脉血管壁肌层厚度变化

模型组术后1、2、4、6周对比对照组血管壁肌层厚度分别升高了2.7%、6.6%、20.0%和24.3%(均P< 0.05)；对比模型组干预组分别降低了0.8%、2.8%、10.2%和13.5%(均P< 0.05)(见图3)。给药6周时干预组降低幅度最大。

注：与对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与相应模型组比较，+P< 0.05，++P< 0.01.图3 大鼠主动脉血管壁肌层厚度变化Note.*P< 0.05, vs. the control group.**P<0.01, vs. the control group. +P< 0.05, vs. the model group.++P< 0.01, vs. the model group.Figure 3 Changes of the thickness of muscular layer of the rat aortic wall

2.4 大鼠腹主动脉CRT和caspase-12免疫组化染色

术后6周CRT和caspase-12免疫组化观察：胞质染成棕色，核被染成蓝色，模型组腹主动脉中膜肌层CRT和caspase-12表达较对照组增多(均P< 0.05)；干预组CRT和caspase-12表达对比对照组有增多但无统计学差异，对比模型组两者均减少(P< 0.05)(表1，图4)。

2.5 大鼠动脉血管组织中ERS分子——CRT、Caspase-12表达变化

Western blot 检测CRT：术后1、2周时对比对照组表达分别升高了172.6%、和83.3%(均P< 0.01)，4、6周时下降(见图5)。术后1、2周对比模型组，干预组CRT降低了53.3%和37.5%(均P< 0.01)，6周时 CRT表达变化不大(见图5)。

Western blot 检测：模型组caspase-12在术后1周时降低，对比对照组下降了20.2%(P< 0.05)，2、4、6周表达分别升高了30.1%、43.6%和56.8%(均P< 0.05)，(见图5)。术后2、4、6周干预组对比模型组caspase-12分别降低了14.2%、39.9%和75.5%(均P< 0.05)(见图5)。

表1 CRT和caspase-12免疫组化染色Table 1 Changes of CRT and caspase-12 expression in the smooth muscle of tunica media of rat abdominal aortic wall ± s，n=5).Immunohistochemical staining

注：与对照组比，*P< 0.05，**P< 0.01；与模型组比，#P< 0.05，##P< 0.01.

Note：*P< 0.05，vs. the control group.**P<0.01, vs. the control group.#P< 0.05, vs. the model group.##P< 0.01, vs. the model group.

图4 各组免疫组化染色Figure 4 CRT and caspase-12 expression in the aortic wall of the rats(Immunohistochemical staining)

2.6 大鼠动脉VSMC凋亡检测

模型组术前与对照组无差异，但术后1周、2周、4周和6周对比相应的对照组VSMC的凋亡率分别升高了22.3%、33.8%、69.3%和105.2%(均P< 0.05)，递增趋势明显(见图6)。上述实验结果证明腹主动脉狭窄术后大鼠主动脉VSMC的凋亡率时间依赖性的增高，提示细胞的凋亡机制参与高血压发生时的血管重构。

术后各时间点干预组对比相应的模型组VSMC的凋亡率有所下降， 1周、2周、4周和6周凋亡率分别降低了6.4%、7.5%、18.6%(P< 0.01)和32.5%(P< 0.01)，给药4周、6周时干预组降幅明显，有统计学差异(见图6)。表明AST可在一定程度内改善高血压引起的VSMC凋亡，减轻血管重构。

注：与对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与相应模型组比较，+P< 0.05，++P< 0.01。图6 大鼠主动脉VSMC凋亡率的变化Note.*P< 0.05, vs. control group.**P<0.01, vs. the control group. +P< 0.05, vs. the model group.++P< 0.01, vs. the model group.Figure 6 Changes of apoptosis rate of VSMCs in the rats

3 讨论

3.1 腹主动脉狭窄术建立高血压大鼠模型

血压的形成、稳定和变化都与血管本身的结构有密切的关系，高血压发病的诸多因素引起血管结构、功能改变是引起心脏和其他靶器官损伤的基本原因，本研究结果表明：腹主动脉狭窄术后大鼠血压在6周内明显升高，高血压大鼠模型构建成功，同时大鼠血管壁肌层随时间推移有增厚趋势，证明高血压发生发展的中早期即伴有大动脉血管形态结构的改变，这种血管壁肌层增厚的重构效应必然引起血管收缩舒张功能改变，进而影响动脉血压的周期性变化。以上结果和推论表明血管重构机制参与腹主动脉狭窄术构建的大鼠高血压模型的形成。

3.2 ERS参与压力性负荷高血压大鼠的血管重构

早期适度的ERS可促进内质网功能的恢复，具有细胞保护作用，而后期过强的ERS可启动ER途径的细胞凋亡机制，具有破坏清除受损细胞的作用[2-3,9]。本实验特别关注了高血压发生发展过程中的 ERS，分别选取造模术后1、2、4、6周等不同时间点动态观察ERS的保护性因子CRT和凋亡损伤性因子caspase-12的表达情况，以探讨这种ERS双向调节机制在高血压发生发展不同阶段的作用。

在ERS时CRT和GRP78等分子表达上调，二者能启动细胞的自我保护机制[10]。CRT有分子伴侣活性，未折叠蛋白反应，调节细胞内钙离子水平，维持ER的功能相对稳态[10]。本研究结果显示1、2周模型组大鼠CRT表达高于对照组CRT作为保护性分子能对ER内环境进行调节，其分子伴侣活性有助于维持恢复ER蛋白质加工促进细胞功能恢复，增强耐受刺激的能力。但是随着伤害性刺激持续作用，应激时间的延长其表达反而有降低趋势，提示ERS对VSMC的保护作用减弱。相应的，VSMC凋亡率在 1、2周时对比对照组有一定程度的升高(早期细胞凋亡率轻度增加可能与造模方法本身的创伤有一定关系)，但随后4、6周时凋亡率升高程度显著增加，这可能说明在高血压发生的早期，ERS分子CRT通过调节ER稳态起到的一定的保护作用，降低了应激性刺激的损伤，保护VSMC抑制其凋亡，而随后高血压诱发因素的长时间伤害性刺激对细胞的损伤累积加重，细胞已经不能通过ERS的自我保护作用修复自身，启动了细胞的自我死亡程序，凋亡率显著提高。Rizzoni等[11]研究也认为，虽然VSMC凋亡率在早期没有大幅度显著增加，但是血管壁肌层厚度仍然明显增加，这可能与VSMC的增殖和与之相平衡的凋亡活动调节异常有关。

持续和严重的ERS时，ER功能不能恢复，凋亡通路就被启动了[12]，而ERS介导的凋亡途径中，caspase-12 起着至关重要的作用[13]。本研究结果显示模型组caspase-12升高，且这种高表达出现的时间晚于CRT，随着时间推迟这种高表达越显著，这也验证了李炜等人的研究：随着时间的延长，ER伴侣分子的保护作用减弱，内质网凋亡途径开始起主导作用[4]，相应的VSMC凋亡率在4、6周时显著增加。2012年槐勇报道了钙通道阻滞剂可改善ERS抑制压力过负荷高血压大鼠的心肌重构[14]，而本研究证明ERS还参与了压力性负荷高血压大鼠的血管重构，可见心血管系统结构功能的改变与ERS 有密切关系，而这种血管重构是高血压发生发展中的必然结果。

3.3 黄芪通过调节ERS改善高血压血管重构

AST[15]及黄芪甲苷[16]具有降压效应，与其调节血管内皮收缩舒张功能，调节血浆NO[16]、内皮素-1含量[15]，也与其影响降压过程中对压力反射敏感性有关[15]。而本研究结果表明AST可在一定程度内控制血压升高，改善高血压引起的血管壁肌层增厚，且随干预时间延长降压效应和血管重构的保护效应越明显。石海莲等人报道黄芪甲苷长期给药能降低血压,逆转压力过载引起的血管肥厚[16]，证实了本研究结论的可靠性。

此外，本研究还表明AST可通过对ERS保护性因子和促凋亡因子的调节，改善模型大鼠血管壁增厚、VSMC凋亡，减轻血管重构，改善血压。文献复习显示黄芪多糖能调节糖尿病大鼠肝脏组织CHOP(另一ERS的促凋亡因子)表达[6]。结合本研究进一步证明AST可通过调节ERS改善血管重构调节血压。

综上，AST可在一定程度内控制血压的升高，改善高血压引起的血管壁肌层增厚，缓解血管重构，黄芪的这种调节血压、保护血管的作用可能与其调节ERS有一定关系。

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