长链非编码RNA MEG3通过抑制肺鳞癌干细胞特性增强平阳霉素敏感性的作用

孔树佳 李砚文

(昆明医科大学第三附属医院 云南省肿瘤医院，云南 昆明 650118)

2015年我国新发肺癌病例73.3万，死亡61.0万〔1〕。肺癌组织学类型包括小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占全部肺癌的80%，肺鳞癌占30%，是仅次于肺腺癌的病理类型〔2〕。平阳霉素是对鳞癌有效的抗肿瘤药物，其与博莱霉素相比，有较低的毒性和更强的药效〔3〕，研究显示，肿瘤干细胞在肿瘤恶性进展及放化疗抵抗的形成中发挥关键作用〔4〕，长链非编码RNA(LncRNA)母系表达基因(MEG)3可影响多种恶性肿瘤化疗抵抗能力〔5,6〕，但其与平阳霉素抵抗形成的关系尚未有报道。本研究对平阳霉素抑制肺鳞癌细胞的能力及影响平阳霉素抵抗形成的因素进行探究。

1 材料与方法

1.1实验细胞及培养 使用人肺鳞癌细胞系H520(美国模式培养物集存库，ATCC)，培养基：RPMI1640培养基+10%胎牛血清(FBS，美国Hyclone)，培养于CO2细胞培养箱(上海恒字)中：5% CO2，37℃，饱和湿度，1∶2细胞传代，于超净工作台(美国Thermo Fisher)中严格无菌操作。

1.2细胞处理及分组 细胞转染技术外源性上调H520中MEG3的表达：接种对数生长期的H520细胞于50 cm2培养瓶中，将细胞随机分为实验组及空白组，取2支1.5 ml离心管，加入500 μl无血清RPMI1640培养基，并分别加入4 μg 含MEG3全长序列的载体及4 μg空白载体(上海吉凯基因)，室温静置5 min后加入10 μl 转染脂质体lipofectamine 3000(美国Thermo Fisher)并充分混匀，室温静置20 min，无血清RPMI1640培养基洗细胞3次，实验组加入含MEG3全长序列载体的混合液，空白组加入含空白载体的混合液，7 h后RPMI1640培养基+10% FBS 继续培养48 h，得到实验组及空白组细胞。递增浓度梯度法建立平阳霉素(吉林敖东药业)抵抗的H520细胞系：分别以1、2、4、8、16、32、64 μg/ml浓度诱导H520细胞，每个诱导浓度维持细胞稳定生长1 w，诱导期间每2 d更换新的平阳霉素与RPMI-1640培养基+10%FBS混合液，筛选至细胞于64 μg/ml浓度中可稳定生长，作为抵抗组，未处理的H520细胞作为对照组。

1.3荧光定量(RT-q)PCR技术检测细胞MEG3表达 抵抗组及对照组细胞、实验组及空白组细胞于转染完成后48 h采用TRIzol(日本Takara)抽提总RNA，超微量分光光度计(美国Molecular Devices)检测RNA浓度，逆转录试剂盒(日本Takara)对1 μg RNA行逆转录，得到相应的cDNA模板，无核酶水(美国Thermo Fisher)稀释至100 nmol/(L·ml)，每个上样孔按10 μmol/L上游引物及下游引物(由上海生工生物工程公司合成)、5 μl cDNA模板及10 μl SYBR Green荧光染料体系进行上样，引物序列：MEG3：正义链5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，反义链5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：正义链5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反义链5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。7500实时荧光定量PCR系统(美国Applied Biosystems)检测MEG3及GAPDH荧光强度，以GAPDH为内参基因，2-△△CT法计算MEG3的表达量。

1.4Western印迹法检测细胞八聚体结合转录因子(Oct)-4及性别决定区Y框蛋白(Sox)-2表达水平 收集50 cm2培养瓶中的各组细胞，细胞数>1×106个，RIPA裂解液(上海生工生物工程公司)重悬细胞，冰上裂解细胞2 h，离心机(德国Eppendorf 5417r)，4℃，离心10 min，取细胞上清液，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(上海生工生物工程公司)检测总蛋白浓度，30 μg行10%聚丙烯凝胶电泳，100 V电压转聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore)，脱脂牛奶封闭1 h，1∶1 000 Oct-4(美国Abcam，ab18976)孵育45 KDa条带，1∶1 000 Sox-2(美国Abcam，ab92494)孵育34 KDa条带，1∶1 000 GAPDH(美国Abcam，ab181603)孵育37 KDa条带，室温孵育3 h，1∶2 000羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美国Abcam，ab6721)孵育各条带1 h，电化学发光(ECL)底物(美国Thermo Pierce)孵育条带1 min，ChemiDoc XRS+化学发光成像系统(美国Bio-Rad)曝光显影，以相对灰度值表示蛋白表达水平。

1.5细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测细胞平阳霉素半抑制浓度(IC50) 将各组细胞接种至96孔板，浓度2×103个/孔，设置0、5、10、20、40、80 μg/ml浓度梯度，每组设置5个平行样本，12 h后以含相应浓度平阳霉素的RPMI-1640培养基+10%FBS混合液替换原有培养基，处理24 h后，CCK-8试剂(日本同仁化学)与RPMI-1640培养基+10%FBS 1∶8混合液替换含平阳霉素的培养基，生化培养箱中孵育1 h，酶标仪(美国Molecular Devices)检测各样本450 nm处吸光度(OD)值，OD值表示细胞活力。

1.6统计学方法 SPSS17.0软件进行独立样本t检验、回归分析。

2 结 果

2.1各组细胞MEG3、Oct-4及Sox-2表达水平比较 实验组MEG3表达水平显著高于空白组，差异具有统计学意义(t=5.837，P<0.01)；抵抗组MEG3表达水平显著低于对照组，差异具有统计学意义(t=4.513，P<0.01)。实验组Oct-4表达水平显著低于空白组，差异具有统计学意义(t=2.597，P<0.05)；抵抗组Oct-4表达水平显著高于对照组，差异具有统计学意义(t=2.846，P<0.05)。实验组Sox-2表达水平显著低于空白组，差异具有统计学意义(t=3.892，P<0.01)；抵抗组Sox-2表达水平显著高于对照组，差异具有统计学意义(t=4.604，P<0.01)，见表1。

表1 各组细胞MEG3、Oct-4及Sox-2表达水平比较

与空白组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与对照组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2各组细胞平阳霉素IC50的比较 实验组平阳霉素IC50显著低于空白组〔(8.21±1.48)μg/ml vs (13.39±2.02)μg/ml〕，差异具有统计学意义(t=2.994，P<0.01)，见图1；抵抗组平阳霉素IC50显著高于对照组〔(32.50±7.26)μg/ml vs (12.67±3.61)μg/ml〕，差异具有统计学意义(t=8.238，P<0.001)，见图2。

图1 实验组与空白组平阳霉素IC50值的比较

图2 抵抗组与对照组平阳霉素IC50值的比较

3 讨 论

平阳霉素对多数鳞癌细胞均具有较佳的疗效，目前作为口腔鳞癌及舌鳞癌的一线用药广泛应用〔7,8〕，但其对于肺鳞癌的疗效鲜有报道。LncRNA是一类长度大于200 nt的非编码RNA，其不编码蛋白，直接通过表观遗传、转录及转录后修饰等机制发挥生物学作用〔9〕，MEG3作为其中的一员被发现与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，其可抑制胃癌、前列腺癌、膀胱癌及NSCLC等多种恶性肿瘤细胞〔10～13〕，且影响肿瘤细胞化疗抵抗的形成：Li等〔5〕研究显示，MEG3可通过促进细胞凋亡显著提高结直肠癌细胞奥沙利铂的敏感性；Liu等〔6〕研究发现，MEG3在顺铂抵抗的NSCLC组织及细胞中表达下调，在顺铂抵抗的NSCLC细胞中外源性上调MEG3后，细胞顺铂敏感性恢复，表明MEG3对NSCLC顺铂敏感性存在促进作用；Zhou等〔14〕研究显示，MEG3在伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病患者中表达显著下降，伊马替尼抵抗的K562细胞中表达同样显著降低，过表达MEG3后，伊马替尼抵抗的K562细胞增殖能力显著下降，细胞凋亡增加，且伊马替尼敏感性增强；同时MEG3还可促进脑胶质瘤细胞及卵巢癌细胞对顺铂的敏感性〔15,16〕。本实验结果显示，平阳霉素可有效抑制肺鳞癌的细胞活力，是有效的抗肺鳞癌药物，在野生型肺鳞癌细胞H520中外源性上调MEG3可显著增强H520细胞平阳霉素的敏感性，且H520平阳霉素抵抗细胞株MEG3的表达出现显著下调，提示MEG3对肺鳞癌细胞平阳霉素敏感性存在重要促进作用。肿瘤干细胞是控制肿瘤恶性行为的关键因素，包括肿瘤细胞的无限增殖、侵袭转移及放化疗抵抗，Oct-4及Sox-2是干细胞特征性标志物，两者相互作用，共同维持肿瘤的干细胞特性〔17〕。Balci等〔18〕研究指出MEG3在脑肿瘤干细胞中表达显著下调，由此推测MEG3可能影响肺鳞癌干细胞特性，进而调控其对平阳霉素的敏感性，本研究显示，上调MEG3后H520细胞Oct-4及Sox-2均显著下调，在平阳霉素抵抗细胞系中Oct-4及Sox-2显著上调，提示肿瘤干细胞与平阳霉素抵抗的形成密切相关，且MEG3可通过抑制肺鳞癌干细胞特性，增强其对平阳霉素的敏感性。