复方健耳剂干预小鼠老年性耳蜗感音神经细胞凋亡径路

陈思仲 唐俊波 宣伟军 韦瑀龙 宣毅

(广西中医药大学 1第一临床医学院耳鼻咽喉头颈外科，广西 南宁 530023； 2瑞康医学院制药厂； 3 School of Engineering,Tufts University)

研究表明〔1～3〕，复方健耳剂具有明显对抗小鼠耳蜗毛细胞与螺旋神经节神经元凋亡,保护听力的作用，其作用机制与其干预含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)介导程序性联级反应细胞死亡途径有关，然而，细胞凋亡径路涉及因子众多而且复杂，因此其药理作用机制仍未明了，本文以C57BL/6J小鼠老年性聋为模型，观察复方健耳剂干预Fas配体(L)、细胞色素(cyt)C基因、caspase-3因子表达影响，探讨中药防治老年性聋作用机制。

1 材料和方法

1.1材料 动物老年性聋模型建立〔1～6〕，选择1月龄刚断奶国产健康C57BL/6J小鼠15只，由北京维通利华实验动物技术公司提供〔批号:SCXK(京)2012-0001〕，雌雄不拘，随机分为2月龄对照组、7月龄对照组和7月龄中药组各5只。对照组自断奶后饮用自来水直至月龄，中药组自断奶后饮用中药溶液以代替日常饮水直至7月龄。

mRNA合成单链扩增逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，荧光定量PCR引物设计在NCBI数据库查找相关序列，由北京六合华大基因科技股份有限公合成，GoldView Ⅰ型核酸染色剂购于上海索莱宝生物科技有限公司，总RNA抽提试剂盒由美国Axygen公司提供。采用美国Bio-Rad实时定量聚合酶链反应(PCR)检测系统。

1.2实验药物及用量 复方健耳剂主要由葛根、丹参、黄芪、骨碎补等组成。经过水煮、浓缩、烘干、反复粉碎和过筛等流程，制成每克药粉相当于6.63 g生药材。小鼠与成人用量换算法计算出该药的小鼠用量3.65 g/(kg·d)〔7〕。1～3月龄，中药粉加适量比例水配兑(一般为0.05 g药粉加5 ml水)，盛于动物自吸喂养瓶内供小鼠饮用,在无其他水源供应的条件下，动物每日饮下规定的内服中药剂量，待成长至4月龄后，改用人工灌喂法以进一步确保每日饮下足量中药。

1.3实时定量PCR 对耳蜗cytC、FasL、caspase-3 mRNA检测 选择PCR参考引物序列ACTB(5'-3'):上游AGTGTGACGTTGACATCCGT,下游AGTAACAGTCCGCCTAGAAGC。PCR目标引物序列FasL(5'-3'):上游GAGGTCTGTGACTGAGGGAC,下游AAACGGCCTCTGTGAGGTAG;cytC上游AATCTCCACGGTCTGTTCGG,下游GGTCTGCCCTTTCTCCCTTC;caspase-3 上游CCACGTGGGAAAGTGAACCA，下游CAGGGCTATTGCTGGATGCT。将各组断头取耳蜗，置液氮中冰冻备用。按照总RNA小量制备试剂盒步骤提取总RNA，即将样品剪成小块，缓冲液R-Ⅰ溶液震荡洗脱下软组织，缓冲液R-Ⅱ振荡混匀，离心取上清，分别加入异丙醇、缓冲液W1A、 缓冲液W2振荡均匀并离心，弃滤液，最后加无水RNase离心洗脱得RNA。总RNA琼脂糖凝胶中电泳，判断总RNA完整性。微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，样本浓度均在100～300 ng/μl的范围。按照反转录反应试剂盒说明，取等量总RNA加入DNA Eraser缓冲液，无水RNase补充总体积，依次加入PrimeScript缓冲液、无水RNase、RT Primer混合物、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ进行反转录PCR反应合成cDNA。加入引物，在实时定量PCR仪检测系统中，反应条件为95℃预变性10 min,然后95℃15 s,60℃ 1 min,共40个循环，60℃延伸1 min,测出内参基因ACTB和目的基因FasL、cytC在不同样本中扩增的Ct值，2-△△Ct法计算基因表达量差异倍数值。

1.4统计学方法 应用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

7月龄对照组较2月龄对照组FasL、cytC、caspase-3表达均明显增高(P<0.05)。7月龄中药组cytC、FasL、caspase-3表达量均值则显著低于7月龄对照组(P<0.05)，与2月龄对照组比较则仅caspase-3水平差异显著(P<0.05)。见表1。

表1 3组耳蜗组织cytC、FasL、caspase-3 mRNA表达比较值，n=5)

与2月龄对照组比较:1)P<0.05；与7月龄对照组比较:2)P<0.05

3 讨 论

细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，是细胞内由基因编码调控的、按严格程序执行的细胞自杀过程，又称程序性死亡(PCD)，它广泛存在于各种细胞中，与许多人类疾病的发病机制密切相关,其中神经元死亡过程更多的是以凋亡形式表现，而凋亡的主要效应蛋白包括caspase家族的蛋白酶，caspase级联激活介导的细胞凋亡是目前公认的经典途径〔8,9〕，它是一组具有相似的氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶家族，它的活化与细胞凋亡密切相关，它的激活主要通过线粒体途径和细胞膜途径〔10，11〕。线粒体途径主要由cytC激发诱导。cytC是一种众所周知的线粒体蛋白，通过向呼吸链传递电子来维持ATP产生，从而完成维持生命的功能，然而，在凋亡机制的激活过程中，一旦线粒体受到某种有害因素影响后，不但导致能量代谢障碍，产生大量超氧阴离子，并通过链式反应形成活性氧，使线粒体膜通透化，引起跨膜电位崩溃的同时，引起cytC从线粒体中外漏，在胞质内触发内源性凋亡通路中caspase级联激活，即与细胞凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1结合，在dATP/ATP存在条件下活化caspase-9，caspase-9再激活下游效应caspase-3等，最终导致细胞染色质凝聚和DNA裂解为碎片等细胞死亡特征，即诱导细胞凋亡〔12～15〕。通过不同龄小鼠视网膜细胞线粒体动力学研究发现〔16〕，感光能量伴随着年龄老化而明显下降与反映线粒体代谢有关的蛋白如线粒体分裂和融合蛋白——线性体内源发动蛋白(OP)1A蛋白、cytC氧化酶等伴随着年龄下降有关，因此认为与年龄相关的疾病和细胞死亡与线粒体功能随年龄增长而下降密切相关。而Fas是一种319氨基酸1型跨膜糖蛋白,有3个外半胱氨酸重复结构域和内80个氨基酸结构域，称为位于C-末端的死亡域(DD)。FasL是Fas的配体，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，其N端150个氨基酸为肿瘤坏死因子(TNF)超家族同源区，FasL也是CD8+T细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞的主要效应因子之一，它可与膜上3个Fas分子结合，并通过其胞内DD与胞质中Fas相关DD(FADD)结合，继而通过 FADD末端死亡作用区域(DED)与邻近的caspase-8中的DED结合，使caspase-8寡聚化，自身裂解而活化caspase-8，然后激活下游的caspase-3导致细胞凋亡，其中上游的启动子caspase-8激活后，还可以通过酶解Bcl-2家族中的Bid，变成tBid，使线粒体膜通透性改变，引起cytC释放，导致caspase联级反应，使细胞凋亡。而Bcl-2与Bid相反，可阻止线粒体膜通透化，从而阻止cytC释放，抑制细胞凋亡，因此，该途径又称死亡受体途径。Fas-FasL与TNF一样，是活化caspase诱导细胞凋亡的细胞膜途径的关键启起因子〔17～19〕。文献报道〔11〕，Fas和FasL在正常中枢神经系统中也有表达，但在炎症和退化的大脑中表达增加，并被认为参与了中枢神经系统的免疫抑制状态。Fas和FasL的表达在多种神经系统疾病中显著升高，提示这种系统可能在中枢神经系统的退行性和炎症反应中起重要作用。因此，在中枢神经系统中，FasL系统应被视为一把双刃剑:维持正常脑内免疫抑制状态，诱导神经细胞死亡和炎症反应，Fas-FasL被称为一个典型的负责细胞介导的细胞毒作用、诱导外源性细胞死亡系统。通过对青年小鼠和老年小鼠研究发现〔20〕，伴随着年龄增长，眼组织和血液中FasL表达增加，由此诱导基质金属蛋白酶(MMP)增多，脉络膜新生血管减少，以至老年性视功能下降，眼部激光治疗能够降低FasL表达，抑制MMP，从而促进脉络膜新生血管增多；通过对老年、中年、青年人血细胞Fas/FasL比较显示〔21〕，老年人Fas/FasL明显增加，同时分析认为，老年人Fas/FasL高表达，与T淋巴细胞亚群比例失调导致免疫功能下降，由此介导的细胞凋亡关系密切。本次研究中cytC基因代表了cytC水平，由此提示，老年性耳蜗感音神经细胞凋亡出现可能是同时通过线粒体和细胞膜两种途径介导caspase级联激活引发细胞PCD，这与前述文献报道老年性相关疾病可通过细胞膜Fas-FasL激活和(或)线粒体功能障碍引起cytC异常增加并外泄引起细胞凋亡相符〔19～21〕,同时还提示复方健耳剂具有保护线粒体，防止cytC外泄或稳定细胞膜，抑制FasL,以阻止其触发caspase引起细胞PCD的药理作用。

研究表明〔1～6〕，在C57BL/6J小鼠老年性聋模型中，2月龄听力学和耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元形态学保持正常状态，7月龄则出现以高频听力损害为主，耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元凋亡以耳蜗基底部为重的病理变化，由此证实耳蜗感音神经细胞凋亡伴随着年龄增长而出现从耳蜗底回向顶回不断发展趋势，听功能损害也相应出现从高频向低频不断发展的规律，中药制剂防治显示其具有显著对抗老年性耳蜗感音神经细胞凋亡和保护听力的作用，中药防治具有显著降低caspase-3表达的药效作用〔2〕，与本次研究一致，由此提示，caspase是引起耳蜗感音神经细胞凋亡的相关生化级联反应的重要系统，是中药药理作用机制的关键环节。之前研究还表明，复方健耳剂可以提高小鼠耳蜗组织脑源性神经营养因子(BDNF)的表达〔22〕，由此认为其保护耳蜗感音神经细胞作用可能机制除了可通过膜结合型GTP/GDP结合蛋白(Ras)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径产生系列生物学作用,即酪氨酸蛋白激酶(Trk)B是BDNF的功能型受体，是信号转导所必需，BDNF与TrkB结合，通过 Ras-MAPK信号转导途径发挥其生物学作用，或通过激活神经元特定的信号传递途径或影响转录因子结合DNA活性，来保护神经元免受氧化应激损伤等作用外〔23，24〕，近年研究证实〔25〕，BDNF可降低β淀粉样蛋白(Aβ)诱导caspase-3和钙蛋白酶激活，通过全长型酪氨酸蛋白激酶B受体(TrkB-FL)激活促进神经元存活，并且通过BDNF介导的腺苷A2A受体激活，保护突触可塑性、传输和神经递质的释放功能，因此，BDNF还能降低caspase-3活性，从而阻止细胞PCD〔25，26〕。但是，理论上影响caspase通路的因素错综复杂，中药还通过其他何种径路启动，最终阻止caspase-3介导的细胞凋亡有待研究。