高危型人乳头瘤状病毒感染和p16INK4A在食管鳞癌患者中的预后价值

王宁宁 王展梅 曹芳丽 曲琳莉 孟思博 玄甜甜 孙颖

(1山东大学齐鲁医院(青岛)化疗科，山东 青岛 266035；2聊城市人民医院肿瘤科)

在发展中国家，食管癌是非常常见的消化道恶性肿瘤，预后不佳〔1〕。我国北方地区是食管癌发病率最高的地域之一〔2〕，据2015年最新统计，食管癌发病率位居第3，仅次支气管肺癌、胃癌〔3〕，死亡率次于支气管肺癌、胃癌、肝癌，居肿瘤相关死亡的第四位，5年生存率仅10%左右〔4〕。世界上每年超过55万的新发恶性肿瘤患者与HPV感染有关〔5〕。根据以前的研究报道，人乳头瘤病毒(HPV)16是最常见的感染类型，其次常见的是HPV18〔6〕，其他亚型的HPV感染极为罕见〔7〕。1981年Syrjänen提出了食管癌发生的诱因之一为HPV感染〔8〕，之后越来越多的研究发现HPV感染是食管癌发生发展的一个危险因素，但HPV感染在肿瘤的发生发展中的致癌机制不清楚，具有争议。回顾性的临床研究中，HPV阳性的患者比阴性的患者具有较好的预后〔9～13〕。基于以前的研究，我们试图确定食管癌中HPV感染和p16的表达，我们也试图评估p16和HPV感染在进行根治术的食管鳞癌患者中的预后价值。我们希望找到一个更合理的治疗方式，我们最大的目标是希望可以利用现有的和正在开发的HPV疫苗，通过大规模疫苗接种预防和治疗这些HPV相关的恶性肿瘤。

1 材料与方法

1.1病人和组织标本 我们查询山东大学齐鲁医院的病案室有关食管癌患者的资料，选择2006年12月至2008年1月行食管癌手术的273例患者为研究对象，排除术前进行放化疗的患者及术后30 d内死亡的患者，其他的排除标准包括：非鳞状细胞的病理类型、不能合作及失访的患者，所有患者要求18岁以上，山东大学齐鲁医院伦理委员会备案。具有足够的蜡块进行切片行各项检测的共有105例患者符合入组标准，所有患者签写书面的知情同意书。105例患者有足够的蜡块进行切片行各项检测，每1例患者经HE染色确诊为食管鳞癌，术后临床分期以2010版AJCC分期为标准〔14〕。2011年全新修订的中国居民膳食指南中指出，饮酒史以0.025 kg/d为分界线。血红蛋白分界点为男性120 g/L和女性110 g/L。105例患者中男81例，女24例，中位年龄60(42～78)岁，中位随访时间42.4(4～61)个月。39例患者检测p16阳性。

1.2手术 食管癌根治术的类型包括Ivor-Lewis和三切口(右开胸，开腹和左颈部切口)。大多数患者接受了Ivor-Lewis手术(n=92)。

1.3随访 所有患者随访至死亡或满5年。随访时间为从手术日期至死亡或最后一次接触之日。术后2年内每3个月复查，以后每6个月复查病情，项目包括体格检查、血液及影像检查，必要时进行食管镜检查。常规的临床参数是从住院患者数据库或山东大学齐鲁医院门诊肿瘤登记处获得。

1.4实验室检查 石蜡切片常规处理后用生物素标记的高危型HPV16或者HPV18标记的DNA探针进行检测，信号放大后二氨基联苯胺(DAB)系统显色，苏木精复染。以HPV阳性的子宫颈鳞癌为阳性对照，其棕染的颗粒位于细胞核内，不采用HPV标记探针的结果为阴性对照。食管鳞状细胞癌胞核内染色为棕色定义为HPV感染阳性〔15〕。所有的结果判定在不知p16结果的情况下进行。免疫组化检测p16：应用Envision-System法，抗体为鼠抗人p16INK4a单克隆抗体一抗(克隆号：GK500715,Dako，1∶100)，进行信号放大后DAB系统染色，苏木精复染。阳性对照采用p16阳性表达的切片，阴性对照通过不加一抗获得。HPV感染阳性的食管鳞癌细胞核呈棕色染色。≥70%的细胞质或(和)细胞核棕染判定为p16阳性。结果由不了解本研究的病理科医师判定。

1.5研究终点 研究的主要终点是总生存期，定义：从手术日期至死亡或随访的最后日期的时间。次要终点包括无进展生存期，定义为从手术日期至局部或远处复发的时间。局部复发是指区域淋巴结转移，或肿瘤局部复发。无肿瘤复发的死亡或者原因不明的死亡认定为局部疾病进展相关的死亡。

1.6统计学分析 采用SPSS16.0软件进行Mann-Whitney检验、χ2检验、Kruskal-Wallis检验。生存曲线采用Kaplan-Meier法制作，生存率差异分析采用Log-rank检验。HPV阳性/阴性的风险比分析采用Cox比例风险模型。

2 结 果

2.1p16与食管鳞状细胞癌患者临床及病理因素的相关性 p16阳性的患者表现为较高的分化程度，更好的体能状态，并且吸烟较少(P<0.05)，见表1。

表1 食管鳞癌105例患者p16阳性表达(n)

1)Kruskal-Wallis

2.2p16蛋白表达与HPV感染的分析 免疫组化染色显示p16蛋白在食管鳞癌组织的细胞质和(或)细胞核内呈棕染表达；39例患者中86.2%的患者(29例)HPV阳性，原位杂交染色显示食管鳞癌组织感染的HPV也在细胞核内表达，同样呈棕染，见图1。66例p16阴性的患者中仅4例患者(6.1%)检测到HPV阳性，Kappa检验后，Cohen Kappa系数为0.61，p16与HPV两者的表达具有一致性(P<0.001，Kappa = 0.61;95%CI=0.45～0.77)。

图1 食管鳞状细胞癌中p16、HPV阳性表达(×200)

2.3生存分析 根据Kaplan-Meier检验结果，p16阳性组患者较HPV阴性组预后较好，p16阳性患者的5年生存率为64.1%，HPV阴性患者5年生存率为45.5%(HR=0.49，95%CI=0.26～0.91，P=0.02)。HPV阴性组患者5年无进展生存率为37.9%，p16阳性组患者5年无进展生存率为58.7%(HR=0.45，95%CI=0.24～0.83,P=0.007)。应用HPV作为分层因素进行预后分析的结果与上述结果一致。HPV阳性组和阴性组的5年生存率分别是64.1%和45.5%(HR=0.31，95%CI=0.14～0.68;P=0.004)。HPV阳性组和阴性组的5年无进展生存率是58.7%和37.9%(HR=0.33，95%CI=0.16～0.68，P= 0.002)。

单因素分析有意义的预后因素包括血红蛋白(HR=1.71,95%CI=0.54～6.29,P=0.39)、T分期(HR=1.04,95%CI=0.58～2.12,P=0.69)、N分期(HR=1.79,95%CI=0.85～3.78,P=0.13)、吸烟(HR=0.81,95%CI=0.46～1.51,P=0.43)、ECOG体能状态(HR=3.08,95%CI=1.08～9.04,P=0.04)和p16蛋白表达(HR=4.23,95%CI=1.75～8.54,P=0.03)，经总生存率和无疾病进展率的Cox回归分析，对总生存率有影响意义的因素是p16蛋白表达和ECOG体能状态；经血红蛋白、T分期、N分期、吸烟、ECOG体能状态等因素校正后，p16蛋白表达是影响患者无疾病进展率的唯一多变量因素(HR=2.52,95%CI= 1.12～5.71,P=0.02)。p16阳性患者较阴性患者降低了58%的死亡风险(校正后HR=0.42,95%CI=0.26～0.91,P=0.03)，降低了61%的疾病进展风险(校正后HR=0.39,95%CI=0.27～0.77,P=0.02)。

3 讨 论

HPV是一种小的双链脱氧核糖核酸病毒。本研究结果显示31.4%的食管鳞癌组织感染HPV，这个结果与既往中国其他食管癌高发区的研究结果是一致的〔16,17〕。本研究的患者来自于山东大学齐鲁医院，山东省在中国属于食管癌的高发区〔18〕。

HPV感染鳞状上皮后p16蛋白会出现过度表达已经成为大家公认的结果，在HPV相关的鳞癌组织中p16免疫组化染色早已被认定为一个客观的HPV感染的生物标志物〔19〕。HPV阴性的肿瘤组织中，9p21的灭活降低了p16蛋白的表达，因此，通过p16蛋白的免疫组化染色来区分肿瘤组织中HPV的阳性或阴性，HPV阴性的食管鳞癌组织中p16蛋白一般呈低表达〔20〕，通常认为p16蛋白水平升高是E7癌蛋白发挥功能的结果，而E7蛋白是HPV感染组织后恶性转化的关键〔21〕。回顾性研究反复报道HPV相关性肿瘤具有较好的预后，这些研究主要是头颈部肿瘤，尤其是口咽部鳞状细胞癌〔16～20〕。本研究揭示了p16和HPV感染在食管鳞癌中的预后价值，p16阳性的患者具有较好的预后。应用HPV作为分层因素，预后结果与上述结果大致相同。

本研究通过免疫组化检测p16和原位杂交法检测HPV，认为免疫组化p16可作为一种有效的HPV检测替代办法。免疫组化技术操作简单，重复性好，成本低，适合于广泛地临床推广和使用〔12〕。

本研究清楚地表明，p16阳性表达的患者具有较高的肿瘤的分化程度和较好的体能评分，并且p16阳性的患者吸烟的概更低。这3个方面之间显著差异可能是解释p16阳性患者较好的原因。另外1个假说也可以解释这种现象，HPV结合到DNA中，表达癌蛋白：E6和E7，消弱了p53和Rb蛋白的功能，促进了基因重组〔22〕，重组的DNA理论上对放疗和化疗更加敏感〔23〕，为HPV阳性患者具有较好预后提供了一个假说。本研究样本小，无法排除混杂由HPV感染和治疗模式带来的混淆结果，所以不能一定得出确切的定论，需要更大的、多层的分析研究来解释说明这种结果。

HPV感染和吸烟之间的联系仍在研究中，有研究表明二者之间具有协同作用〔24〕，烟草诱发的相关的致癌基因的变异可能因为HPV感染，进一步重排，加剧DNA突变，基因组的不稳定性造成细胞周期紊乱，这可以解释为什么P16阳性患者不太可能是吸烟者，需要进一步的研究证实。

本研究表明，在食管癌中p16蛋白表达与分化程度有关，可以作为肿瘤分化程度的一个参考指标。本研究还发现较高的ECOG评分与p16阳性率有关，ECOG评分低的患者p16蛋白阳性率较低。以前的研究也报道过ECOG体能状态与p16蛋白的关系，但二者之间的关联目前没有明确的解释，可能与这些研究的样本量小有关〔25〕。

本研究明确表明经根治术后HPV相关性或者p16阳性的食管癌患者具有较好的预后，而且HPV感染或p16蛋白是独立的预后影响因子。但由于本研究是小样本回顾性研究，而且随访中出现了部分失访，还需进行较大样本量的前瞻性研究证实p16蛋白表达与HPV感染两者之间的一致性及p16蛋白在分子生物学水平上作为预后因素的可行性。