RBM5、EGFR和KRAS在非小细胞肺癌中的表达及其意义

赵 敏，田 畅，邸 鑫，金 鑫，丛 珊，刘伽莹，李然伟，王 珂*

(吉林大学第二医院 1.呼吸与危重症医学科，2.泌尿外科，吉林 长春130041)

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的最恶性肿瘤，预计2018年新增肺癌病例210万例，死亡180万例，占癌症死亡人数的五分之一(18.4%)[1]。肺癌通常分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)[2]。我国每年新发肺癌病例约73.3万例，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%-85%[3]。肺癌患者五年总生存率为17%，而临床IV期的肺癌患者的五年生存率低于2%[4]。因此积极探索肺癌的发病机制，发现新的肺癌相关生物标志物对改善肺癌患者的治疗和预后至关重要。

RNA结合基序蛋白-5(RNA binding motif 5， RBM5)是RBM(RNA Binding Motif)家族成员之一，也是RBM家族中最受关注的成员。RBM5 (也被称为 g15、LUCA-15及H37)位于假定的人类肿瘤抑制基因区域3p21.3。这个区域共有19个基因，这19个基因都在不同程度上表现出了相应的肿瘤抑制作用，RBM5位于这19个基因的末端[5-7]。RBM5主要分布于细胞核，具有识别、结合RNA，参与机体内RNA转录、翻译、基因表达、细胞增殖以及调控细胞周期及凋亡等功能，目前研究证实，RBM5是潜在的肿瘤抑制因子[8]。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号转导系统在非小细胞肺癌(NSCLC)的发病中起了非常重要的作用，尤其在腺癌的发病过程中。研究表明，80%的NSCLCs患者，EGFR的表达增高[9]；20%的肺癌患者组织中(多见于支气管肺泡癌及腺癌)HER2的表达增高[10]；同时也发现，在许多不同病理类型的肺癌中，鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)的表达明显增高。除此之外，研究发现[11]：腺癌病人的KRAS、EGFR及HER2的基因突变多与吸烟史有关。例如：EGFR的基因突变多见于无吸烟史的腺癌病人(尤其是亚洲女性)；而KRAS的基因突变多见于有吸烟史的腺癌及鳞癌病人(非亚裔男性)；KRAS的基因突变也见于无吸烟史的腺癌病人，但其突变类型不同于有吸烟史的腺癌及鳞癌病人。

本课题组[12]前期研究已经证实：在人非小细胞肺癌组织中肿瘤抑制基因RBM5表达降低，癌基因EGFR,KRAS表达增高，提示RBM5基因表达缺失与EGFR,KRAS基因过表达共同参与了非小细胞肺癌的发生。在人非小细胞肺癌中RBM5蛋白表达水平与EGFR、KRAS蛋白表达呈负相关，RBM5可能作为EGFR途径的上游基因，可在体内微环境中，通过增加RBM5表达下调EGFR、KRAS水平的途径，抑制肺癌组织、细胞增殖。

对驱动基因及突变基因的检测是针对NSCLC患者国内、外诊治的共识，但该技术因所需组织标本取材困难，操作流程繁琐，周期长，对设备要求高，故难以推广，且目前大多数研究项目及临床应用主要是针对已经诊断的肺癌或肺癌晚期病人，从而指导NSCLC患者靶向用药方案，故组织中目的基因的检测尚不能也不适合做到NSCLC早期诊断及疗效评估。而本实验将组织中基因水平的检测，转化为血清中目的蛋白的检测，相比较于组织的取材困难，患者血清的获得较为简单，而基因水平的检测也较蛋白水平的检测较为繁琐，故如果血清中驱动基因和突变基因表达水平与组织中具有较高的相似性，我们便可以用血清中目的基因表达水平的检测来代替组织中目的基因的检测，从而做到NSCLC早期诊断及疗效评估。

本研究通过测定组织及血清中上述基因表达水平，比较组织与血清表达水平差异，分析三者与临床病理类型，淋巴结转移，吸烟史，年龄，性别等的关系；从而为非小细胞肺癌的精准诊治提供更方便快捷的实验室检测方法。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2017年8月至2018年8月在吉林大学第二医院收治的44例非小细胞肺癌(NSCLC)患者作为实验组，所有患者均经术后病理或支气管镜活检病理证实为非小细胞肺癌(其中有2例经支气管镜活检病理证实，故只有血清，无癌组织与癌旁组织)。其中鳞状细胞癌22例，腺癌22例；按照国际肺癌研究学会(IASLC)2017年颁布的第8版肺癌TNM分期[13]进行划分：Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例。其中男性32例，女性12例，年龄为46-78岁，平均年龄为61.00±7.27岁；选取同期健康体检人22例作为对照组，其中男性10人，女性12人，年龄为47-83岁，平均年龄61.00±11.05岁；经相关检查未发现肺癌或其他肿瘤性疾病。

1.2入组标准及排除标准非小细胞肺癌入组患者结合临床症状、体征，均经病理学确诊为非小细胞肺癌，均具有完整的病历资料。排除存在严重心脏及肝肾疾病、自身免疫性疾病、严重并发症等情况患者。

1.3主要试剂和仪器Light Cycler 480Ⅱ高通量实时荧光定量PCR仪(罗氏,美国)，TransZol Up PLUS RNA Kit(北京全是金生物技术有限公司，中国)， TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal) (北京全是金生物技术有限公司，中国),DNA引物合成(生工生物有限责任公司，中国)，TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全是金生物技术有限公司，中国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国)，兔抗RBM5多克隆抗体(生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)Human EGFR ELISA KIT(R&D，美国),Human KRAS ELISA KIT(R&D，美国)，Human RBM5 ELISA KIT(江莱生物，中国)，Thermo Scientific Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(赛默飞世尔科技，美国)

1.4RT-QPCR法检测组织中RBM5、EGFR、KRASmRNA表达水平用Trizol法提取上述肺癌及癌旁组织标本中总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA,RT-PCR法检测RBM5、EGFR、KRAS的相对表达水平，引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。根据Ct值采用法计算癌及癌旁组织目的基因的相对表达水平，△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值。

1.5Westernblot法测定组织中RBM5、EGFR、KRAS蛋白表达水平采用RIPA裂解缓冲液冰上裂解组织，BCA法测定蛋白浓度，每个样品取30 μg上样，10%SDS-PAGE,将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂乳封闭2 h，与上述基因抗体(按说明书稀释比例稀释)，4℃孵育过夜。经PBST洗涤3次，加入HRP标记的相应二抗(稀释比例1∶2000)，室温摇床孵育40 min，TBST洗涤3次，加入ECL显色，采用化学发光成像仪检测目的蛋白的相对表达水平，内参采用β-actin。

1.6ELISA法测定NSCLC和正常人血清中RBM5、EGFR及KRAS蛋白表达水平严格按RBM5、EGFR和KRAS检测试剂盒进行操作，检测RBM5、EGFR和KRAS的表达水平。加样，37℃温育30 min，洗涤5次，加酶标抗体50 μl，温育、洗涤，加显色液显色，检测其吸光度(A)值，根据标准曲线计算出RBM5、EGFR和KRAS的水平。

1.7统计学分析采用SPSS 24.0 统计软件进行统计学分析。先对数据进行正态性检验，根据实验数据是否符合正态分布,使用t检验或Wilcoxon符号秩检验进行统计分析。检验水准α=0.05。用GraphPad Prism 6.0软件作图。

2 结果

2.1肺组织中RBM5、EGFR和KRASmRNA及蛋白表达水平

肺癌和癌旁组织中上述基因mRNA表达水平(2Δct)均呈非正态分布。

2.1.1癌旁组织RBM5 mRNA的表达水平最小值为1.77×10-3，最大值为3.73，中位数为4.54×10-2，95%区间距为0.051-0.655。肺癌组织RBM5 mRNA的表达水平最小值为5.45×10-3，最大值为0.33，中位数为3.35×10-2，95%区间距为0.034-0.071；肺癌组织中RBM5 mRNA的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)。

2.1.2癌旁组织EGFR mRNA的表达水平最小值为4.14×10-3，最大值为0.30，中位数为3.65×10-2，95%区间距为0.036-0.094。肺癌组织EGFR mRNA的表达水平最小值为17.74×10-3，最大值为1.10，中位数为5.04×10-2，95%区间距为0.028-0.168。肺癌组织中EGFR mRNA的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。

癌旁组织KRAS mRNA的表达水平最小值为0.80×10-3，最大值为0.99，中位数为2.59×10-2，95%区间距为0.073-0.288。肺癌组织KRAS mRNA的表达水平最小值为6.92×10-3，最大值为0.97，中位数为5.53×10-2，95%区间距为0.116-0.311；肺癌组织中KRAS mRNA的表达水平高于癌旁组织,但二者之间没有统计学差异(表2)。非小细胞肺癌组织中RBM5蛋白质表达水平较癌旁组织降低，EGFR蛋白水平升高，KRAS表达水平没有明显变化。(图1)。

P:para-carcinoma tissues;T:tumor

Fig.1ExpressionofRBM5,EGFRandKRASproteininNSCLCtissueandpara-tumortissuebyWesternblot

2.1.3其中伴有淋巴结转移的非小细胞肺癌EGFR mRNA表达水平显著高于无淋巴结转移的非小细胞肺癌EGFR mRNA表达水平(P<0.05)；与癌旁组织对比，男性组、低年龄组、无吸烟史组、鳞癌组及有淋巴结转移组癌组织中RBM5 mRNA表达水平降低(P<0.05)；高年龄组、无吸烟史组及腺癌组，组织中EGFR mRNA表达水平升高(P<0.05)；临床Ⅰ期以及无淋巴结转移组，非小细胞肺癌组织中KRAS mRNA表达水平升高(P<0.05)(表3)。

Tab.2 Levels of RBM5,EGFR and KRAS mRNA in NSCLC

Tab.3 Association of RBM5,EGFR,and KRAS mRNA with clinicopathological characteristics in NSCLC

*：There was significant difference between tumor and para-carcinoma tissues (P<0.05);#:The specific clinical categories in cancer tissues were significantly different (P<0.05).

2.2血清中RBM5、EGFR和KRAS蛋白表达水平

血清中上述基因蛋白表达水平均呈正态分布，正常对照组中的RBM5蛋白表达水平为(7.74±1.98 ng/ml)，肺癌患者血清中RBM5蛋白表达水平为(4.74±1.62 ng/ml)，肺癌患者血清中RBM5蛋白表达水平显著低于正常对照组(P<0.01)，其中有淋巴结转移组RBM5蛋白表达水平(4.18±1.19 ng/ml)明显低于无淋巴结转移组RBM5蛋白表达水平(5.30±1.81 ng/ml)(P<0.05)；正常对照组中的EGFR蛋白表达水平为(7.61±1.91 ng/l)，肺癌患者血清中EGFR蛋白表达水平为(10.51±2.37 ng/l)，肺癌患者血清中EGFR蛋白表达水平显著高于正常对照组(P<0.01)。正常对照组中的KRAS蛋白表达水平为(2.97±0.71 ng/ml)，肺癌患者血清中KRAS蛋白表达水平为(3.82±1.13 ng/ml)，肺癌患者血清中KRAS蛋白表达水平显著高于正常对照组(P<0.01)(图2)。

Fig.2 Levels of serum RBM5,EGFR and KRAS protein ；**：P<0.01vs control group

3 讨论

目前肺癌是世界范围内癌症相关死亡率最高的肿瘤性疾病，每年死亡率18.4%[1]。近年来新型肺癌相关生物标志物的发现及应用对于改善肺癌尤其是非小细胞肺癌的早期诊断、治疗及预后起到至关重要的作用。大量研究结果显示：RBM5是调节癌细胞基因转录和mRNA剪接的核蛋白。在神经鞘瘤和75%原发肺癌样本中发现RBM5的表达明显低于正常组织[14,15]。而目前关于EGFR和KRAS在癌症中的研究已经证明：EGFR是由细胞外配体结合域和细胞内酪氨酸激酶域组成的170kD跨膜糖蛋白，它在许多上皮性肿瘤中异常激活，导致细胞增殖、侵袭、转移和预后差，而更重要的是在40%至85%的初级NSCLC可以检测到EGFR的表达[16]。RAS家族三个成员在细胞中的突变广泛发生在多种人类癌症中，其中KRAS的突变是RAS家族成员中最常见的。RAS家族中大约在30%的人类癌症中发现了突变；当然，这其中也包括肺癌[17]。在本研究中，利用RT-qPCR法对RBM5、EGFR及KRAS在NSCLC组织与癌旁组织的mRNA表达进行检测，结果显示RBM5在癌组织中的表达含量明显较癌旁组织低,EGFR的表达含量明显升高，KRAS没有明显相关性，并且经过Western blot验证组织蛋白质也符合这一趋势，这与梁红[12]等人的研究结论相似。进一步分析三种基因与临床及病理相关性发现，在男性组、低年龄组、无吸烟史组、鳞癌组及有淋巴结转移组癌组织中RBM5 mRNA表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)。高年龄、无吸烟史及腺癌组，非小细胞肺癌组织中EGFR mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。临床Ⅰ期以及无淋巴结转移组，非小细胞肺癌组织中KRAS mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。根据Amos CI[18]的报道：只有不到11%的重度吸烟者最终发展成恶性肿瘤，提示吸烟与NSCLC的发病并无特定关系。相关研究人员同样证明吸烟对3p21.3这一片段抑癌作用并没有明显影响[19]，而我们实验的结果得出非吸烟者中癌与癌旁组织中RBM5和EGFR表达含量差异显著，我们实验结论也补充了无吸烟组的RBM5表达水平癌与癌旁组织差异大。而在Snjezana Dogan[20]发现EGFR突变在43%的不吸烟者(NS)和11%的吸烟者中。我们的实验结果也与其相符，在无吸烟史的癌组织中EGFR表达明显高于癌旁组织。相关研究表明，EGFR通路在细胞增殖、血管生成和存活中起重要作用。鉴于其对细胞周期进展、凋亡、血管生成、肿瘤细胞运动和转移的影响，它显然与肿瘤的生长和进展有关[21]。我们的实验结果也验证了这一结论，有淋巴结转移的非小细胞肺癌EGFR mRNA表达水平显著高于无淋巴结转移的非小细胞肺癌EGFR mRNA表达水平(P<0.05)。这可以指导我们更好的应用EGFR的靶向治疗药物治疗非小细胞肺癌。

目前已有多项[22]研究论证了检测血清中EGFR表达含量作为肺癌诊断指标的可行性；而Dr.Ryan[23]课题组得出血清中KRAS2突变体是结直肠肿瘤复发临床症状表现前的潜在标志；目前还没有任何关于血清RBM5与癌症的报道。本研究结果显示血清RBM5、EGFR及KRAS在健康者及非小细胞肺癌中都有表达，并且在非小细胞肺癌患者血清中RBM5表达水平低于健康者(P<0.05)，而EGFR和KRAS表达高于健康者(P<0.05)。此结果与组织中RBM5、EGFR的结果具有高度相似性，但也得出KRAS在非小细胞肺癌患者血清中高表达这一结论，此结论与梁红[12]等人在测定癌组织中KRAS表达情况时，得出结论一致，以上结果提示血清RBM5、EGFR及KRAS可作为非小细胞肺癌患者新的血清标志物。Oh等人[19]发现肿瘤抑制因子RBM5/H37改变参与转移相关的基因的表达，表明RBM5表达的缺失可能增加肿瘤的转移潜能。我们的研究结果得出伴有淋巴结转移的NSCLC患者血清中RBM5表达含量低于无淋巴结转移患者中血清中，证实了RBM5表达降低与转移相关的临床病理特征之间的显著关联，支持上述研究。该结论也与彭杰等人[24]在研究胰腺导管癌中RBM5与淋巴结转移相关性得出的结论类似。提示血清RBM5可能是预测非小细胞肺癌淋巴结转移的一项指标，与非小细胞肺癌转移有相关性。

综上所述，RBM5和EGFR在非小细胞肺癌患者无论是病理标本还是血清中都存在相同趋势，与淋巴结转移均有相关性，而我们检测到KRAS只在NSCLC患者血清中有明显升高，在此推测肿瘤抑制基因RBM5在NSCLC发生发展过程中起到负性调控作用，而EGFR和KRAS起到正性调控作用；血清中RBM5和EGFR可能成为判断肿瘤早期转移新指标以及肿瘤新治疗靶点。

作者简介：赵敏(1994-)，内蒙古自治区包头市人，在读医学硕士；王珂，教授，主任医师，博士研究生导师。