凝血因子的多点稀释分析(MDA)方法在筛查病理性抗凝物中的应用

程 航,冀续峰,刘海艳,李 瑞,安倍莹*

(1.吉林大学第一医院 小儿呼吸一科,吉林 长春130021；2.吉林大学白求恩第一医院 检验科,吉林 长春130021；3.吉林省白城市镇赉县人民医院 检验科,吉林 白城)

病理性循环抗凝物质临床常见于获得性的凝血因子抑制物和狼疮性抗凝物质。获得性的凝血因子抑制物可直接作用于一种特异性凝血因子引起出血,临床研究发现有相当多的A型血友病患者,在经过若干次输血后,机体会产生抗凝血因子Ⅷ的抗体,从而结合Ⅷ因子,降低了治疗效果[1,2]。狼疮抗凝物(Lupus anticoagulants,LAC)是一种磷脂依赖的病理性循环抗凝物质,为IgG或IgM的异质性免疫球蛋白。主要通过结合β2糖蛋白I(β2-glyeoprotein I,β2-GP I)、人凝血酶原(prothrombin,PT)及其他磷脂复合物来干扰磷脂依赖的凝血过程,使凝血时间延长[3]。持续的LAC阳性患者被认为有较高的血栓形成和复发风险,与不明原因习惯性流产、死胎、易栓性疾病及某些自身免疫性病的危险信号[4,5]。这两类病理性抑制物都会引起APTT延长,干扰凝血因子的定量检测,因此在凝血因子定量检测时凝血因子含量低的患者中,需要排除是否存在病理性抑制物的干扰引起的假性减低。

多点稀释(Multi dilution analysis,MDA)分析是指样本按照不同的稀释度进行稀释(1/1、 1/2、 1/4、 1/8等),在不同的稀释倍数下,由于凝血因子的促凝过程是一系列酶促反应的过程,反应的速度和强度在一定范围内与凝血因子的活性(浓度)线性相关,故稀释后各浓度血浆的凝血因子促凝活性通过乘以稀释倍数,可回归为相同(相近)的结果。如果单纯的凝血因子缺乏,经过多点稀释分析,稀释比例和因子浓度呈线性,该凝固曲线和标准曲线应该是平行的,若存在病理性的抗凝物质如FⅧ抗体,稀释后随着凝血因子FⅧ和凝血因子FⅧ抗体浓度同时下降,失去抗原抗体反应的最适比例,稀释后的曲线和标准曲线呈交叉[6,7]。

本研究采用多点稀释的方法测定FⅧ:C,根据样本曲线和标准曲线的关系来来筛查样本中是因子含量缺乏、或者存在抗因子抗体或是存在狼疮抗凝物质导致的因子含量缺乏,评价MDA作为筛选病理性抗凝物的试验作初步研究。

1 对象和方法

1.1 研究对象

2017年10月至2018年10月期间住院诊断血友病A患者102例,中位年龄26岁(1岁-70岁),血友病A严重程度依据世界血友病联盟推荐的标准进行分型[8]。14例抗磷脂综合征的患者。正常对照组20例,男女各半,均来自我院健康体检者,无心、肝、肾病史,无服药史,年龄在20-66岁。

1.2 方法

1.2.1标本采集与制备

所有受检者均空腹采集109 mmol/L枸橼酸钠抗凝血2.7 ml,抗凝剂与样本体积比例为1∶9。样本采集后2 h在室温下1 500×g,二次离心10 min,以保证如乏血小板血浆中血小板计数<10×109/L。血浆-80℃冻存,检测前37℃水浴快速复融。标本无黄疸、无乳糜、无溶血。

1.2.2仪器及试剂

采用Sysmex 公司的CS-5100全自动凝血分析仪器及配套试剂,基于测定APTT的一期凝固法检测FⅧ:C,选择多点(1/1、 1/2、 1/4、 1/8、1/16等)稀释方法(MDA)进行。

1.2.3抑制物确证实验

采用改良的Bestheda法检测FⅧ抑制物浓度滴度[9],制备标准曲线,用Dade Behringer缓冲液倍比稀释患者乏血小板血浆,在对照管中加入等体积缓冲液,将以上各管均加入等体积正常人血浆,采用 Sysmex CS-5100全自动凝血分析仪及配套试剂,从FⅧ标准曲线测得各管中FⅧ活性,将倍比稀释患者乏血小板血浆测得的FⅧ活性与对照管FⅧ活性比较,计算各管残留FⅧ%,查表 1得Bethesda单位,将查得的Bethesda单位乘稀释倍数即得抑制物量。

1.2.4狼疮抗凝物质(LAC)检测

采用改良的稀释蝰蛇毒时间(Dilute Russell′s viper venom time,dRVVT) 检测LA(为美国Beckman 公司试剂),采用采用IL-TOP 700 全自动凝血分析仪检测狼疮抗凝物质,按试剂盒厂家提供的方法计算标准化的LA 比值,LA 比值>1.2 为阳性。

1.2.5APTT纠正实验

APTT血浆纠正试验,包括即刻和孵育后的APTT纠正实验。等体积的正常混合血浆和患者血浆混合,即刻混合及混合后37℃孵育2h后分别测定APTT。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17．0软件进行结果统计学分析。以经典的改良的Bestheda方法测定FⅧ抗体和dRVVT确诊实验为“金标准”,应用四格表评价MDA法作为筛查抗因子抗体和狼疮抗凝物的筛查实验的敏感度、特异度和准确度等。

2 结果

2.1 MDA检测不同凝血FⅧ含量的曲线形式

20份正常体检者混合血浆,配置不同浓度的FⅧ血浆,通过MDA检测凝血因子Ⅷ的活性,验证样本曲线和标准曲线的关系,如图1,当FⅧ：C ≥10%,样本曲线和标准曲线大致平行；在FⅧ：C <10%,样本曲线和标准曲线开始交叉；当FⅧ严重缺乏,如FⅧ<1%,虽然二者曲线也有交叉,但是因子浓度基本不随着稀释梯度改变而改变。与国外文献结果报道相似[6]。

图1 MDA测定不同浓度的FⅧ样本曲线和标准曲线的关系

102例血友病A患者中,60例样本曲线和标准曲线大致平行,FⅧ：C均在10%以上,血浆即刻和2 h孵育纠正实验均是阴性,不存在病理性抗凝物质,说明在凝血因子FⅧ:C>10%时,可以通过MDA样本曲线和标准曲线是否交叉来判断标本凝血因子含量缺乏或者存在病理性抗凝物质；16例患者曲线也为交叉,纠正实验判断无病理性抗凝物质,测FⅧ：C较低,在1%-5% 之间,属于中重度血友病患者。

2.2 MDA筛查抗因子抗体的结果

见表1,MDA筛查抗FⅧ因子抗体的敏感度80%,特异性68.3%,阳性预示率38%,阴性预示率93%,准确率71%；MDA显示随着稀释度的增加,由于存在抗FⅧ抗体,因子含量和凝固时间不成比例,导致标准曲线和样本曲线交叉,经过Bestheda测定抗FⅧ抗体滴度在3B.U.以上(图2),MDA联合血浆纠正实验筛查FⅧ抗体,诊断效能明显增强,敏感度80%,特异性87%,阳性预示率61.5%,阴性预示率94.7%,准确率86%,见表2。

表格1 MDA筛查抗FⅧ抗体和Bestheda方法测定结果比较

图2 含有FⅧ抗体的MDA图形

表2 MDA联合血浆纠正实验筛查抗FⅧ抗体和Bestheda方法测定结果比较

2.3 MDA筛查狼疮抗凝物的结果

见表3,MDA筛查狼疮抗凝物的敏感度71%,特异性63.6%,阳性预示率23%,阴性预示率93%,准确率64.7%； MDA显示随着稀释度的增加,由于狼疮抗凝物的存在,因子含量和凝固时间不成比例,随着稀释度增加,削弱了干扰因子凝血的能力,导致因子的含量反而增加,如图3。

表3 MDA筛查抗狼疮抗凝物和dRVVT 方法测定狼疮抗凝物结果比较

MDA联合血浆纠正实验筛查LAC抗体,结果为敏感度71%,特异性82%,阳性预示率38%,阴性预示率94.7%,准确率80%,见表4。

3 讨论

病理性抗凝物质是一种循环抗凝物质,通常属于免疫球蛋白IgG抗体,实验室诊断病理性抗凝物质的确证试验操作较为复杂,如测定抗FⅧ抗体的Bethesda或Nijmegen方法或者ELISA方法；或者方法学的限制,如检测狼疮抗凝目前尚无参考物质和参考方法,分析前、分析中诸多因素(如样本的准备、筛查试验的检测试剂和方法选择)均可影响检测结果的准确性和重复性,其临床应用效果不好,这些确证实验均不合适作为病理性抗凝物质的筛查方法[10]。

图3 含有狼疮抗凝物质的MDA结果

MDA+纠正实验dRVVT阳性阴性合计阳性(交叉)101626阴性(平行)47276合计1488102

本研究通过凝血因子的多点稀释分析方法(MDA)的原理,根据样本曲线和标准曲线的关系,评价了MDA作为筛查抗因子抗体或狼疮抗凝的实验的诊断性能。首先通过收集20份正常人混合血浆,配置不同比例的FⅧ浓度,通过MDA方法测定FⅧ含量,观察标本曲线和标准曲线的关系,结果证实了在FⅧ因子缺乏时,浓度FⅧ在100%,80%,60%,40%,即 FⅧ>10%,二者曲线是平行的；当FⅧ≤10%,虽然不存在病理性抗凝物质,但是二者曲线也出现不同程度的交叉,可能与仪器的性能检测有关,此时斜率一般在0.9-1.0之间,与存在病理性抗凝物质的斜率有所不同[6,11]；当因子极度缺乏时,如FⅧ<1%,样本曲线几乎与X轴平行,提示因子的含量很少基本不随稀释度的改变而变化。

其次,本研究分别评价了MDA和MDA联合血浆纠正试验在筛查抗FⅧ抗体或狼疮抗凝物质筛查实验的效能,MDA作为诊断抗因子抗体实验的效能敏感度80%,特异性68.3%,阳性预示率38%,阴性预示率93%,与血浆纠正实验联合时,其特异性明显增加,特异性87%。那么,MDA作为诊断狼疮抗凝物实验的效能敏感度71%,特异性63.6%,阳性预示率23%,阴性预示率93%,准确率64.7%,联合血浆纠正实验筛查LAC抗体,特异性大大增加,特异性81%。因此,MDA可以作为筛查病理性抗凝物质的方法,但是MDA与血浆纠正实验联合应用可以更好的筛查病理性抗凝物质并且判断抗凝物质的种类。

因此,日常工作中我们可以充分利用全自动化凝血仪器上的MDA功能,通过选择多点稀释的方法测定凝血因子含量,不仅可以排除病理性抗凝物质的干扰,准确测定患者体内凝血因子含量,而且通过曲线的交叉模式,可以快速、简便、准确判断样本中是否存在病理性抗凝物质,为临床早期诊断和治疗提供更多、更准确的实验室诊断依据,同时也是对不能开展病理性抗凝物质定量检测的实验室的补充。