生晒参不同提取物对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

白玉洁 ，郑斯文 ，郑厚胜 ，逄世峰 ，王英平 *

（吉林农业大学中药材学院，长春130118；2.中国农业科学院特产研究所，长春130112）

人参（Panax ginseng C.A.Mey）为五加科人参属植物，微温、甘、微苦，具有大补元气、补脾益肺、复神益智等功效[1]。主要分布在中国、韩国等地。现代药理实验表明，人参具有调节血糖[2]、促进造血功能[3]、抗疲劳抗氧化[4]、增强免疫力[5，6]的作用。生晒参为人参的主要炮制品，其主要活性成分主要是人参皂苷与人参多糖，但现在对于生晒参提取物免疫活性研究较少。环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物，具有广谱的抗癌作用，同时还具有较强的免疫抑制作用，可以严重抑制小鼠免疫功能[7～9]。本实验以环磷酰胺作为免疫抑制剂，研究生晒参不同提取物对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

雄性 SPF级 BALB/c小鼠，体重 20±2 g，购于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物许可证号SCXK（吉）2017-0005。小鼠自由饮食饮水，室温23.0～25.0℃，湿度55%～65%，适应性饲养一周后进行实验。

1.2 药物与试剂

生晒参购于集安康美新开河（吉林）药业有限公司，经吉林省参茸办公室冯家研究员鉴定为5年生五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey）的根；环磷酰胺（江苏盛迪医药有限公司）；刀豆蛋白、红细胞裂解液、红细胞保存液 （索莱宝生物科技有限公司）；Enhanced Cell Counting Kit-8 （CCK-8）（上海碧云天生物技术有限公司）；无支原体胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；RPMI1640培养基 （美国 Hyclone公司）；白细胞稀释液（江苏建成科技有限公司）；IFN-γ、TNF-α试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司）。

1.3 仪器设备

KDC-40低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；ZHJH-C1115C智能安全型超净工作台 （上海智城分析仪器制造有限公司）；BB150二氧化碳培养箱（美国Thermo Scientific公司）；水浴锅（常州润华电器有限公司）；电子微量天平（上海越平科学仪器有限公司）；酶标仪（美国Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 样品的制备

生晒参醇提物：生晒参切片，75%酒精醇提，过滤后合并滤液，旋蒸得浸膏，得率为30%，含水量为30.36%，4℃保存备用；

生晒参水提物：生晒参切片，50℃恒温水提，料液比为1∶5，提取时间5h，提取 3次，过滤后合并滤液，旋蒸得浸膏，得率为37.5%，含水量为60.22%，4℃保存备用；

2.2 动物分组、造模及给药

实验分3批进行，每批雄性BALB/c小鼠50只，随机分为5组，每组10只。设立正常对照组，灌胃（Introgastric，ig）生理盐水，模型组（ig 生理盐水），阳性对照组（ig盐酸左旋咪唑40 mg/kg），醇提物组（ig醇提物 340mg/kg），水提物组（ig 水提物 800mg/kg），除正常对照组外，其余各组于灌胃后25 d开始腹腔注射CTX（80 mg/kg），连续注射5d，建立小鼠免疫功能低下模型。造模期间正常灌胃给药，累计灌胃30 d。

2.3 小鼠免疫器官指数的测定

小鼠于末次注射CTX后24h，称量小鼠体重，颈椎脱臼处死，解剖，取胸腺及脾脏，剥除周围结缔组织，生理盐水冲洗残血后滤纸吸去多余液体，称量其重量并记录。

2.4 小鼠外周血白细胞数的测定

小鼠于末次注射CTX后24h，小鼠眼球静脉丛采血于抗凝剂中，混匀，取20 μL于0.38 mL的白细胞稀释液中，混匀，显微镜下计算白细胞数。

2.5 细胞免疫

2.5.1 小鼠脾淋巴细胞增殖反应

2.5.1.1 小鼠脾淋巴细胞悬液的制备

各组小鼠于末次注射CTX24h后，颈椎脱臼处死后，超净台内无菌取脾，去除结缔组织及脂肪，用大号注射器芯研磨，过200目筛网，制成单细胞悬液。台盼蓝染色后进行活细胞计数（95%以上），10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液调细胞浓度为3×106个/mL。

2.5.1.2 ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖实验

本实验采用CCK-8法测定小鼠淋巴细胞增殖程度。调细胞浓度为3×106个/mL。设对照孔：脾细胞悬液 100μL；刺激孔：脾细胞悬液 100μL加 conA（终浓度为 5μg/mL）； 空白孔：1640 完全培养液 100μL。37℃，5%CO2培养箱中孵育68h后，每孔加CCK-8显色剂10μL，继续孵育1h，在450nm下测吸光度值。淋巴细胞增值率用刺激指数SI来表示。

SI=对照孔/刺激孔

2.5.2 迟发型变态反应 （DTH）

2.5.2.1 绵羊红细胞（SRBC）

绵羊颈静脉取血，将羊血放入盛有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动10min，以脱纤维，静置后用生理盐水洗涤3次 （3500r/min，10min），制备压积SRBC。

2.5.2.2 致敏

小鼠于检测前4d，以2%（v/v）SRBC腹腔注射致敏，每只 0.2mL（约 1×108 个 SRBC）。

2.5.2.3 DTH的产生与测定

采用足趾增厚法测定。4d后，用游标卡尺测量小鼠左侧足趾厚度，测量3次，取平均值，并在测量处注射 20%（v/v）SRBC 20μL，24h 后再次测量小鼠足趾厚度 ，测量3次，取平均值。以攻击前后足趾厚度的差值来表示DTH的程度。

2.6 单核-巨噬细胞功能测定

2.6.1 小鼠碳廓清实验

小鼠末次注射CTX24h后，小鼠尾静脉注射4倍稀释后的印度墨汁（0.1mL/10g），注射完成后立即计时。在注射后2min、10min时分别采血，立即取20μL加至2mL0.1%Na2CO3中，混匀，在600nm处测波长；并解剖小鼠，取肝、脾并称重。以吞噬指数a表示小鼠碳廓清能力。

2.7 细胞因子的测定

各组小鼠于末次给药24h后，小鼠摘眼球取血，离心，得到小鼠血清样本，采用ELISA的方法按试剂盒说明书中操作方法检测IFN-γ、TNF-α的含量。

2.8 统计学处理

用DPS统计软件进行数据统计，实验数据以均值（x ）±标准差（s）表示，两两比较采用 LSD 法，P<0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 生晒参不同提取物对免疫功能低下小鼠器官指数及白细胞数的影响

如表1所示，与正常对照组比较，模型组小鼠器官指数及白细胞数显著降低 （P<0.01）。与模型组比较，生晒参醇提物、水提物可以明显提高小鼠脾指数与白细胞数（P<0.05，P<0.01）。

表1 生晒参不同提取物对免疫功能低下小鼠器官指数及白细胞数的影响 （x±s，n=10）

3.2 生晒参不同提取物对免疫功能低下小鼠细胞免疫的影响的影响

如表2所示，与正常对照组比较，模型组小鼠脾淋巴细胞增值能力与小鼠足趾厚度显著降低 （P<0.01）。与模型组比较，生晒参醇提物与水提物可以明显提高小鼠脾淋巴细胞增值能力与迟发型变态反应。（P<0.05，P<0.01）。

表2 生晒参不同提取物对免疫功能低下细胞免疫的影响 （x±s，n=10）

3.3 生晒参不同提取物对单核-巨噬细胞能力的影响

如表3所示，与正常对照组比较，模型组小鼠碳廓清显著降低（P<0.01）。与模型组比较，生晒参醇提物、水提物可以明显提高小鼠碳廓清能力（P<0.05，P<0.01）。

表3 生晒参不同提取物对免疫功能低下单核-巨噬细胞免疫的影响 （x±s，n=10）

3.3 生晒参不同提取物对IFN-γ与TNF-α含量的影响

如表4所示，与正常对照组比较，模型组小鼠IFN-γ与TNF-α含量显著降低 （P<0.01）。与模型组比较，生晒参醇提物、水提物可以明显提高小鼠IFN-γ 与 TNF-α 含量（P<0.05，P<0.01）。

表3 生晒参不同提取物对免疫功能低下IFN-γ与TNF-α 含量的影响（x±s，n=10）

4 讨论与结论

CTX作为免疫抑制剂，大量实验研究表明CTX可以造成动物的免疫抑制[7～9]。胸腺与脾是机体重要的免疫器官，对调节免疫系统发挥着重要作用[10]，本实验结果表明CTX可致小鼠免疫器官萎缩，生晒参醇提物与水提物可以明显增强小鼠脾指数。脾淋巴细胞增殖能力与迟发型变态反应可以反应小鼠细胞免疫功能，脾淋巴细胞增殖能力是评价T淋巴细胞功能的重要指标[11]，结果表明生晒参醇提物与水提物可以不同程度提高小鼠脾淋巴细胞增殖能力与迟发型变态反应。巨噬细胞作为体内固有免疫的主要组成部分，可以吞噬与清除异物，发挥免疫监视作用[12]，碳廓清能力可以反应小鼠单核-巨噬细胞功能，醇提物与水提物可以明显提高小鼠碳廓清能力。IFN-γ是体内参与免疫反应的细胞因子，还可以介导炎症反应与迟发型变态反应，TNF-α主要由巨噬细胞分泌，能够刺激NK细胞发挥作用，在宿主防御过程中发挥着重要作用[13]，结果发现生晒参醇提物与水提物可以明显提高小鼠TNF-α与IFN-γ含量。本实验研究发现，生晒参醇提物与水提物对免疫功能低下小鼠发挥免疫调节作用，且生晒参水提物的免疫活性优于醇提物。