葛根有效成份提取新工艺研究

赵 花 ，宁科迪 ，魏建华，曹立军 ，高 峰 (.吉林人参研究院，通化3400;.通化市宁式骨科医院，通化3400）

葛根为豆科植物野葛pueraria lobata (Willd.)O-hwi的干燥根。习称野葛。秋、冬二季采挖，趁鲜切成厚片或小块；干燥。

葛根是最为常用的中药之一，也是属于药食同源的植物。具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，舒经活络，解酒毒等功效[1]。葛根中的有效成分主要是黄酮类，如葛根素、3-甲氧基葛根素、3-羟基葛根素，大豆苷等，其中还含有蛋白质、生物碱以及大量的纤维素、淀粉、果胶等多糖物质。最近，葛根黄酮提取物以及葛根素被发现有改善骨代谢的作用，有可能适用于预防骨质疏松症[2～3]。

1 原料、试剂和仪器

1.1 葛根原料

在GSP认证的山东山水中药饮片有限公司购买。

1.2 试剂

葛根素标准品，吉林省药品检验所；95%乙醇，沈阳市华东有限公司。

1.3 仪器

TU-1901双光束紫外可见分光光度；2A型手提式多功能粉碎机；德国BP211DSartourius电子天平；旋转蒸发器，型号RE-52AA；SHZ-C型循环式多用真空泵。

2 实验方法与结果

2.1 曲线的制作

葛根总黄酮的分析方法采用分光光度法，葛根素的对照品在紫外区250nm处获得稳定的特征吸收峰。因此，直接采用分光光度法在紫外区250nm处测定溶液的吸光度。

准确称取5.5mg葛根素对照品，用95%乙醇溶解并定容于50ml容量瓶中，得到0.11mg/ml的葛根素标准溶液。依次精密吸取该标准溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml于 10ml容量瓶中，蒸馏水稀释定容，得到系列对照品溶液。以250nm处测定对照品溶液的吸光度。得到吸光度A与总黄酮质量浓度C(mg/ml)的线性关系，见图1。

经计算得回归方程为：

Y=2.86032×C+0.02178，相关系数 R2=0.9985。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度的考察

准确称取预处理（干燥恒重）的葛根药材4份，每份1g，分别加入100ml的 10%、30%、50%、70%的乙醇溶液，于80℃条件下加热回流提取120min，将提取液减压抽滤，定容至100ml。

精密吸取1ml滤液，放入10ml容量瓶中加入不同浓度的乙醇定容至刻度线，在250nm处测定吸光度，见图2。

提取溶剂 10%乙醇 40%乙醇 50%乙醇 70%乙醇葛根总黄酮得率% 6.075 6.300 5.659 5.608

由图2可知，葛根总黄酮的得率都是随着乙醇浓度的增大逐渐增加，当乙醇浓度为40%时，得率达到最高，之后葛根总黄酮得率呈下降趋势。因此，本实验选取40%乙醇溶液作为提取溶剂。

2.2.2 提取时间的考察

准确称取预处理（干燥恒重）的葛根药材5份，每份1g，40%乙醇溶液，于80℃条件下分别加热回流提取 30min、60min、90min、120min、150min 将提取液减压抽滤，定容至100ml。

精密吸取1ml滤液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度线，在250nm处测定吸光度，见图3。

提取时间（min） 30 60 90 120 150葛根总黄酮得率% 5.76 5.85 5.98 6.24 6.02

由图3可知，葛根总黄酮的得率都是随着提取时间的延长而逐渐增加，提取时间为120min时，得率达到最高，之后葛根总黄酮得率呈下降趋势。因此，本实验选取最佳的提取时间为120min。

2.2.3 提取温度的考察

准确称取预处理（干燥恒重）的葛根药材4份，每份1g，加入25倍量的40%乙醇溶液，分别在60℃，70℃，80℃，90℃条件下回流提取120min，将提取液减压抽滤，定容至100ml。

精密吸取1ml滤液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度线，在250nm处测定吸光度，见图4。

提取温度（℃） 60 70 80 90葛根总黄酮得率% 6.52 6.61 6.83 6.70

由图4可知，葛根总黄酮的得率都是随着提取时间的延长而逐渐增加，提取温度为80℃，得率达到最高，之后葛根总黄酮的得率呈下降趋势。因此，本实验选取最佳的提取温度为80℃。

2.2.4 溶剂用量的考察

准确称取预处理（干燥恒重）的葛根药材4份，每份1g，分别加入20倍，25倍，30倍，35倍量的40%乙醇溶液，于80℃条件下加热回流提取120min将提取液减压抽滤，定容至100ml。

精密吸取1ml滤液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度线，在250nm处测定吸光度，见图5。

溶剂用量（倍） 20 25 30 35葛根总黄酮提取率% 6.55 6.71 6.65 6.60

图5可知，葛根总黄酮的得率都是随着溶剂用量的增大而逐渐增加。当溶剂用量为30倍时，得率呈下降趋势。因此，从本实验选取25倍量作为溶剂用量。

2.2.5 提取次数的考察

准确称取预处理（干燥恒重）的葛根药材3份，每份1g，分别加入25倍40%的乙醇溶液，于80℃条件下分别加热回流提取1次、2次、3次，每次120min，将提取液减压抽滤，合并提取液定容至100ml。

精密吸取1ml滤液，放入10ml容量瓶中加入40%的乙醇定容至刻度线，在250nm处测定吸光度，见图6。

提取次数（次） 1 2 3葛根总黄酮得率（%） 6.06 6.26 6.12

由图6可知，葛根总黄酮的得率都是随着提取次数的增多而逐渐减少。因此，本实验选取最佳提取次数为2次。

2.3 正交实验设计、各因素水平设置及数理统计分析

根据单因素实验的结果，提取时间，提取温度，溶剂用量，提取次数对葛根总黄酮得率有影响，因此采用正交实验法将每个因素选三水平进行，因素及水平见表1，结果见表2。

表1 正交实验因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

表3 正交实验表 L9（34）Table 3 The orthogonal experiment table L9（34）

以葛根总黄酮的得率为指标，从表2中极差的大小及表3方差分析结果上看，各因素对实验结果法的影响依次为C(提取温度)＞D(提取次数)＞A(提取时间)＞B(溶剂用量)。其中提取温度对葛根总黄酮的得率有显著性影响。

3 结果与稳定性实验

3.1 实验结果

从数理统计分析得出，以40%乙醇为溶剂提取葛根中葛根总黄酮的最佳组合条件为：A2B2C2D2，即提取时间120min，溶剂用量25倍，提取温度80℃，提取次数2次。

3.2 稳定性实验

为了验证优化工艺条件的稳定性，分别按照下列条件进行了三组稳定性试验。提取时间120min，溶剂用量25倍，提取温度80℃，提取次数2次。对葛根总黄酮含量进行测定，结果葛根中总黄酮含量分别为：8.99%，8.91%，8.95%，平均值 8.95%，大于正交设计中的含量，并且具有良好的重复性和较高的准确率，所筛选的提取工艺条件基本稳定，可作为葛根总黄酮的提取方法。