壳聚糖基复合水凝胶在创伤修复中的应用

张冬英，卢思彤，胡章，李思东，李普旺

(1.广东海洋大学 化学与环境学院，广东 湛江 524088；2.中国热带农业科学院 农产品加工研究所，广东 湛江 524001)

皮肤创伤、烧伤、手术等对人体有严重的健康风险，因为隔热，体液潴留和对外源性病原体的保护都依赖于完整的皮肤屏障功能，在手术后伤口护理、烧伤、外部创伤和长期不愈性溃疡等多方面都需要创伤敷料。理想的伤口敷料应保护伤口免受细菌感染，提供湿润和愈合的环境，以减少疤痕形成的风险，具有生物相容性，可促进一系列修复细胞增殖、迁移、以及组织重建等[1]。同时，伤口敷料在使用过程中也应表现出机械稳定性，方便使用和去除，能作为微生物、异物、组织损伤力等外部威胁的屏障[2]。多方面的研究旨在努力开发改进临床相关治疗的方法，达到控制感染和实现急性与慢性伤口的更快愈合的敷料。

水凝胶是指一类由物理或化学交联形成的三维高分子网络体系，性质柔软，能吸收大量的水分并能保持一定的形状。其主要特点有：①高分子基质以物理或化学交联形成的网络结构，网络中充满不能自由流动的溶剂，表现出弹性或黏弹性的半固体性质；②对温度及外界条件敏感；③具有溶胀性、脱水收缩性、触变性、粘合性；④具有易涂展、舒适感、无油腻、易去除，能吸收组织渗出液，不妨碍皮肤的正常生理作用，具有一定的保水作用而促进药物透皮吸收[3]。壳聚糖(CS)是由甲壳素经脱乙酰化后制得的天然聚阳离子多糖，具有良好的促进创伤愈合、抑制瘢痕形成、凝血性、抑菌性等多种作用，是一种生物相容性好、无免疫原性、无刺激性的多功能材料，2001年被美国FDA确认属于GRAS(通常公认为是安全的)物质[4]。本文将近年来壳聚糖通过物理或化学方法复合温敏性材料、仿生部分等制备的水凝胶胶材料在创伤修复的研究进展进行综述和讨论，为进一步开展相关研究工作奠定基础。

1 壳聚糖基温敏性水凝胶

温敏性水凝胶是众多环境敏感水凝胶中被研究最多的水凝胶之一，主要特点是可以响应温度变化而发生溶胶-凝胶转变[5]。随着人们对生物医药材料要求的提高，进一步将温敏性水凝胶作为凝胶体系的研究更加广泛，在生物医学材料领域受到广泛的关注。相比传统水凝胶，温敏水凝胶应用于组织工程、药物递送、3D细胞培养等领域具有显著的优越性。

1.1 壳聚糖/β-甘油磷酸盐温敏水凝胶

壳聚糖有良好生物相容性、低细胞毒性和生物体内可降解性等优点。Chenite等[6]提出了一种基于CS/多元醇盐组合的热敏性水凝胶的新制备方法，成功将CS溶液与β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液混合，在室温，pH 7.15 时不会发生溶胶-凝胶转化，当温度提升至37 ℃时，可迅速凝胶化。当应用在体内注射时，液体制剂原位形成凝胶植入。该凝胶系统可用于在体内递送生物活性生长因子以及组织工程应用的细胞包封基质等，属于一种与生物高度相容的新型热敏性凝胶体系。

为了防止过热、聚焦超声治疗的副作用，Huang等[7]通过使用CS、β-甘油磷酸盐和甘油开发了一种双功能热敏水凝胶。通过调整水凝胶的组成使溶胶-凝胶转变温度与生理温度一致作为热信号，获得优化配方即0.5%CS、5%β-甘油磷酸盐、25%甘油组成的水凝胶具有接近人体皮肤的高声阻抗，衰减系数远低于人体皮肤，超声波传输从25～55 ℃保持在99%。这些特性确保了该水凝胶具有防止过热、聚焦超声的双重功能。Liu等[8]通过壳聚糖-4-硫代丁基脒(CS-TBA)与羟基磷灰石(HA)和β-GP共混，获得机械性能较未改性CS更好的温敏水凝胶。以牛血清白蛋白(BSA)模拟蛋白质释放的结果表明，CS-TBA/HA/β-GP 相比CS/HA/β-GP水凝胶具有更长的持续释放时间，这可能与CS-TBA和BSA间形成的二硫键有关。CS-TBA/HA/β-GP水凝胶具有多孔结构，均匀分布的纳米羟基磷灰石，适当的降解速率和低细胞毒性，在药物递送和组织工程的应用中有一定的潜力。

硫酸软骨素在触发血管修复和细胞迁移中起着重要作用[9-10]。其还具有抗氧化和抗凋亡活性，并在免疫反应中如生长因子活性调节和白细胞募集等发挥作用[11]。通过将碳酸氢钠与β-甘油磷酸酯组合，合成了具有显著机械性能和快速凝胶化速率的壳聚糖水凝胶。Alinejad 等[12]为了改善它们的生物学性能，通过相对简单快速的方法开发了一种主要由壳聚糖与硫酸软骨素组成的热敏和可注射水凝胶。通过评估包封L929细胞的活力和代谢活性来评估添加硫酸软骨素对水凝胶细胞相容性的影响，其pH和重量摩尔渗透压浓度接近生理水平并增强溶胀能力，包封的细胞能够维持活力和增殖能力长达7 d，硫酸软骨素的添加在无血清条件下显著改善细胞活力。该研究证明，用碳酸氢钠和β-甘油磷酸酯的组合制备的壳聚糖-硫酸软骨素水凝胶具有作为热敏、可注射和生物相容性基质的潜力。

氧化纤维素纳米纤维(TOCNF)是一种天然材料，具有许多有前景的特性，包括生物相容性和降解性。Nguyen等[13]将不同浓度的TOCNF与CS结合，通过与β-甘油磷酸酯之间的相互作用构建了一种用于生物医学方面的热敏可注射水凝胶，这种水凝胶可以在体温下进行溶胶-凝胶转变。TOCNF的加入缩短凝胶化时间并增加了孔隙率。与单独CS水凝胶相比，这些含有TOCNF的水凝胶在体外和体内均显示出良好的生物相容性。体内植入7 d后，发现CS/TOCNF出现初始轻微炎症反应，随着时间推移，这种反应在14 d内基本消退。水凝胶内的细胞浸润也是显著的，植入后14 d显示出活化巨噬细胞，并具有抗炎和伤口愈合能力。由此表明，添加TOCNF可显著提高CS水凝胶作为生物医学材料的生物相容性。

1.2 改性壳聚糖温敏水凝胶

热敏羟丁基壳聚糖(HBC)是一种壳聚糖衍生物，具有可逆的温度响应特性和生物相容性。Sun 等[14]为了增强热敏羟丁基壳聚糖(HBC)水凝胶的机械强度，添加甲壳素晶须制备热敏羟丁基壳聚糖/甲壳素晶须(HBCW)水凝胶，HBCW水凝胶显示出坚固的层状形状。通过振荡应力扫描研究了温度、pH值和NaCl浓度对HBCW水凝胶机械强度的影响。结果表明，HBCW水凝胶在37 ℃，pH 12.0时可达到最大刚度(～1 126 Pa)。低pH和高盐离子会降低水凝胶的稳定性，而几丁质晶须可以增加HBCW水凝胶的应力耐受性和相关的破裂应变性。

理想的敷料应具有合适的机械性能、抗感染性和组织相容性好等特征，同时，医生更喜欢能够为伤口愈合提供合适的湿润微环境的敷料。为此，Xia等[15]开发了几丁质晶须(CW)/羧甲基壳聚糖纳米粒子(CMCS NPs)/热敏羟丁基壳聚糖(HBC)复合水凝胶(CW/NPs/HBC-HG)作为治疗慢性伤口的敷料。在引入CW时，复合水凝胶的凝胶温度显著降低和机械性能增强。在37 ℃下，CW/NPs/HBC-HG的储能模量(G0)是NPs/HBC-HG的3.6倍。利奈唑胺是一种广谱抗生素，直接溶于复合水凝胶的水相中，复合水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性达到99%，且维持7 d。当重组人表皮生长因子(rhEGF)被包封到NPs中时，CW/NPs/HBC-HG水凝胶可提供长达5 d的细胞增殖活性。更重要的是，糖尿病大鼠的慢性伤口愈合模型评估显示，CW/NPs/HBC-HG敷料促进伤口愈合并加速再上皮化、胶原沉积和血管生成。这些研究结果表明，CW/NPs/HBC-HG水凝胶是一种有前途的慢性伤口敷料。

聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)在水介质中响应其低临界温度(LCST)附近的温度变化而经历可逆的水合-脱水。Ngadaonye 等[16]在壳聚糖存在下通过快速光聚合交联PDEAAm来合成热响应互穿聚合物网络敷料。该敷料透明，可透过水蒸气，但不可渗透细菌。它们具有温度依赖性和溶胀性能，且在低温下膨胀并变得较少粘合，可调节粘附性的这种能力将促进从伤口部位、特别是烧伤和供体部位去除的无创伤方式。抗菌活性研究证明该敷料控制掺入的抗生素释放的能力，可以通过抑制细菌生长来增强伤口愈合能力。

伤口感染一直是一个常见且高成本的问题。温度敏感性水凝胶因其具有易成型性、易于给药和在伤口上保持潮湿的局部环境，被证明是一种合适的敷料候选者。Zhao等[17]成功制备了一种新型负载β-环糊精-姜黄素的热敏性壳聚糖水凝胶，表征其具有多孔内部结构和持续的姜黄素释放曲线。在大鼠的伤口感染模型中研究了水凝胶的伤口愈合能力。经分析，凝胶复合物的伤口表现出更高的伤口闭合率，这与观察到改善组织学结果相平行。此外，体外抗微生物、抗氧化、蛋白质印迹分析和逆转录-定量聚合酶链反应测定的结果表明，水凝胶复合物具有不同的抗氧化、抗微生物和抗核因子-κB信号传导能力。这些结果表明，这种新型水凝胶是促进皮肤伤口愈合的合适候选者。

壳聚糖基热敏水凝胶被称作为可注射的原位凝胶聚合物。Wang等[18]使用壳聚糖、羟丙基甲基纤维素和甘油制备了一种热敏性水凝胶，其在pH为6.8～6.9，温度为37 ℃条件下凝胶时间为15 min。通过FTIR、XRD、SEM、流变仪表征该热敏水凝胶的分子结构、流变行为、内部结构形态等，进一步研究其降解性、细胞毒性及蛋白质释放行为，研究结果表明，该热敏水凝胶具有良好的流动性、热敏性、可降解性及低细胞毒性和可控释性，显示出在医学应用中的潜在用途。

2 壳聚糖复合仿生部分水凝胶

将仿生部分通过物理或化学方法引入水凝胶或支架已广泛赋予创伤修复敷料的生物学活性。

2.1 复合生长因子水凝胶

合适的微环境将促进细胞增殖和迁移，这有利于早期伤口愈合并防止炎症和疤痕产生。Hu等[19]通过静电相互作用和二价螯合，采用羧甲基壳聚糖(CMC)、海藻酸钠(ALG)和氯化钙制备一系列双交联无定形CMC-ALG水凝胶，并进一步加载表皮生长因子(EGF)。考察了该水凝胶在流变学、溶胀性、保水性、EGF释放和细胞增殖等性能，表明这种无定形水凝胶可以促进细胞增殖并加速伤口愈合，显示出在伤口护理管理方面很有前景。

脂肪来源的干细胞(ASCs)分泌几种血管生成生长因子，可用于治疗缺血性组织，然而，解离的ASCs移植经常导致细胞快速死亡。Cheng等[20]为了开发一种能够让ASCs持续释放，用于促进血管生成的热敏性壳聚糖/明胶水凝胶，将热敏壳聚糖水凝胶中混合明胶，增强了包封ASC细胞的活力。在体外培养期间，明胶的逐渐降解导致ASC从壳聚糖/明胶水凝胶中持续释放。体外伤口愈合测定显示，相比壳聚糖水凝胶，包封在壳聚糖/明胶水凝胶中的ASC共培养的成纤维细胞显示出更快的细胞迁移。另外，在包封ASC的壳聚糖/明胶水凝胶的上清液中发现更高浓度的血管内皮生长因子。使用包封ASC的壳聚糖/明胶水凝胶后，小鸡胚胎绒毛尿囊膜测定和小鼠伤口愈合模型显示出更高的毛细血管密度。相对于单独的ASC或包封ASC的壳聚糖水凝胶，在施用包封ASC的壳聚糖/明胶水凝胶后第5 d在伤口组织中也发现更多的ASC。因此，壳聚糖/明胶热敏水凝胶不仅维持ASC存活，还能够持续释放ASC用于促进血管生成应用，从而在治疗缺血性疾病方面表现出巨大的临床潜力。

为了使骨髓间充质干细胞(BMSCs)在慢性伤口的治疗中发挥其全部潜力，Chen 等[21]开发了基于生物相容性多功能交联剂的温度敏感性水凝胶，并用于递送BMSC，来改善伤口的慢性炎症微环境。研究发现水凝胶与BMSCs结合处理伤口后，载有BMSCs水凝胶组中观察到明显更大的伤口收缩。组织学和免疫组织化学结果证实，该治疗通过促进肉芽组织形成、血管生成、细胞外基质分泌、伤口收缩和再上皮化来促进糖尿病皮肤伤口的快速愈合。这些结果表明载有BMSC的水凝胶可能是治疗糖尿病溃疡的有希望的治疗策略。

促进血管生成治疗法具有生成侧支血管系统的潜力，是治疗肢体严重缺血的有效途径。热响应性水凝胶可以为药物的持续释放提供原位储库，并为包封的活性物质提供保护和内聚。人间充质干细胞(hMSCs)在体内、体外具有强烈的血管生成潜力，去铁胺(DFO)是促血管生成缺氧诱导因子-1α途径的药理学活化剂，已在体内有效显示出促血管生成的效果。Hastings等[22]将hMSC和DFO与热响应性壳聚糖/β-甘油磷酸盐水凝胶结合，起到可注射、多模式促血管生成治疗剂的作用，用于治疗肢体严重缺血。该凝胶在33 ℃开始进行热凝胶化，并在7 d内提供持续生物活性DFO的释放，同时允许包封hMSC的存活、增殖和迁移。包封在含有100 μmol/L DFO壳聚糖热响应水凝胶中的hMSC显示出VEGF表达上调。水凝胶中hMSC和DFO的组合导致生物活性协同增强，该热敏性水凝胶复合制剂显示出在治疗肢体严重缺血的显著潜力。

Zhu等[23]为了开发出良好的真皮替代品，成功制备了模仿人体细胞外基质的水凝胶，可用于组织工程皮肤支架。通过使用转谷氨酰胺酶作为交联剂，将透明质酸(HA)和羧化壳聚糖加入到人类胶原(HLC)中来合成水凝胶，可用于组织工程皮肤支架。研究证明，水凝胶具有良好的生物相容性，可以有效地防止外部细菌侵入伤口，减少炎症反应，且该水凝胶是柔软且多孔的材料，在皮肤修复、药物递送、软骨治疗和其他组织工程应用中表现出良好的潜力。

2.2 复合多肽水凝胶

我国海洋生物资源丰富，大量海产品中含有结构独特、功能强大的天然活性物质。每年新发现的海洋多肽类化合物在海洋天然产物中占有很大的比例，是海洋活性物质研究的重要组成部分。越来越多的研究表明，这些活性产品具有促进伤口愈合、止血、抗菌等功能，有望开发出多种新型天然海洋功能材料。

多肽SIKVAV是一种衍生自层粘连蛋白A蛋白链的肽，并显示出多种生物活性。Lin等[24]发现SIKVAV肽能够促进内皮细胞的粘附和分化，还可以诱导内皮细胞的血管形成，并介导缺血组织的血运重建。研究表明SIKVAV肽是一种有前途的功能单元，可以与底物结合，改善血管生成和细胞粘附能力。血管生成和再上皮化是皮肤伤口愈合的关键因素。Chen等[25]报告了SIKVAV肽-共轭壳聚糖水凝胶的仿生片段，可以促进皮肤再生。体外研究发现这种肽缀合的水凝胶显著促进BMSC粘附和增殖。在体内该水凝胶加速伤口收缩。皮下植入实验和H&E染色结果显示肽修饰的壳聚糖水凝胶显著促进新血管的形成。此外，Masson染色显示许多新生胶原纤维出现在肽-共轭水凝胶组中，而在对照和壳聚糖水凝胶组中仅发现少量新生胶原纤维。同时，肽-壳聚糖水凝胶组快速上皮化，而对照和壳聚糖水凝胶需要更多时间才能完成。这些结果表明，SIKVAV 肽能显著改善壳聚糖在血管生成和皮肤再上皮化中的功能。

Chen等[26]研究了SIKVAV肽在体外可以促进成纤维细胞的细胞增殖和迁移，胶原合成以及多种生长因子分泌的能力。随后，进一步研究了SIKVAV肽修饰的壳聚糖水凝胶促进体内皮肤伤口中生长因子的分泌[27]。结果表明，SIKVAV肽修饰的壳聚糖水凝胶可用于伤口敷料和皮肤伤口的治疗，是有希望的合成生物材料，用于治疗皮肤伤口。

Liu等[28]以微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)为催化剂，将胶原肽(COP)分子接枝到壳聚糖氨基上，得到水溶性壳聚糖-胶原肽(CS-COP)衍生物。再通过CS-COP的氨基与氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)的活性醛基之间发生席夫碱反应制备得该复合水凝胶。这种新型水凝胶样品具有清晰稳定的三维网状结构。同时，研究了添加OKGM对该水胶凝的凝胶时间、溶胀行为、水蒸发速率和凝血能力的影响。该水凝胶显示出良好的溶胀能力、适当的保水能力和良好的凝血能力。此外，细胞毒性实验结果表明该水凝胶具有优异的生物相容性。因此，该水凝胶具有作为伤口敷料应用的潜力。

临床上需要对糖尿病患者的慢性伤口进行更有效的治疗，糖尿病通常涉及内皮功能障碍，因此，靶向再上皮化可以改善当前治疗的效果。Xiao等[29]提出了一种来自血管生成素-1的整合素肽QHREDGS作为糖尿病伤口治疗的治疗候选者，通过研究证明在体外QHREDGS肽促进角质形成细胞粘附和集体迁移，以及通过Akt和MAPKp42/44途径对H2O2应激的存活。在体内，固定在壳聚糖-胶原水凝胶上的QHREDGS肽通过加速再上皮化和肉芽组织形成而促进糖尿病伤口愈合。在正常和糖尿病人原代角质形成细胞和db/db糖尿病小鼠模型的研究结果证明了QHREDGS肽在治疗糖尿病伤口中的潜力。

3 壳聚糖复合其他材料水凝胶

Chen等[30]利用氧化海藻酸盐(OAlg)和羧甲基壳聚糖(CMCS)的醛和氨基之间的席夫碱反应来凝胶化，通过乳液交联法制备负载四环素盐酸盐(TH)的明胶微球(GMs)，然后整合到OAlg-CMCS水凝胶中以制备抗菌和可生物降解的复合水凝胶敷料，用于药物递送和伤口愈合。随着微球比例从10～40 mg/mL的增加，复合敷料表现出较短的胶凝时间和较低的溶胀比，以及较高的机械强度。特别是含有30 mg/mL四环素盐酸盐的明胶微球复合水凝胶敷料，在治疗细菌感染方面具有广阔的前景。

在伤口愈合的过程中非常需要多功能的敷料，包括抗感染、抗氧化和促进伤口愈合过程等，然而其设计仍然是一个挑战。Zhao等[31]开发了一系列基于季铵化壳聚糖-g-聚苯胺(QCSP)和苯甲醛官能化的可注射导电自愈合水凝胶，研究发现这些水凝胶具有良好的自愈合性、电活性、自由基清除能力、抗菌活性、粘合性、导电性、溶胀率和生物相容性。

Noori等[32]为了克服传统伤口敷料的限制而努力开发现代伤口敷料。智能纳米复合水凝胶就是合适的候选者。他们采用冻融法制备了蜂蜜负载PVA/壳聚糖/蒙脱土响应纳米复合水凝胶，并作为一种新型伤口敷料系统，进一步研究评估了其物理、机械、溶胀和释放行为。研究了以蜂蜜为药物模型的合成纳米复合水凝胶的形态和性质。通过X射线衍射法证实了纳米复合材料的剥落形态。20 ℃和37 ℃时在各种pH下进行溶胀研究，结果表明，温度升高导致膨胀增加，pH值达到2时出现最大膨胀。在相同条件下也研究了蜂蜜的体外释放，相应的结果表明在较高pH值下蜂蜜释放速率更快。MTT实验结果显示在纳米复合水凝胶系统中没有表现出细胞毒性，抗菌活性的研究表明，该系统的抗菌活性超过99%。体内研究结果证实了该复合水凝胶系统的伤口愈合能力。研究结果表明所提出的纳米复合水凝胶系统的特性是使其成为伤口敷料的理想选择。

一氧化氮(NO)是一种参与多种生物信号通路的内源性分子。在低浓度(皮摩尔至纳摩尔)下，NO具有调节功能，如促进血管舒张、伤口愈合、细胞增殖、抑制血小板粘附和聚集等。在较高的浓度(微摩尔至毫摩尔)下，NO具有抗肿瘤和抗菌作用[33]。因此，NO被认为是传统抗菌药物的有前途的替代品。NO是一种自由基，设计药物以受控的空间和时间产生治疗量的NO仍然是一个挑战。Pelegrino 等[34]将NO供体S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)掺入到热响应性Pluronic F-127(PL)-壳聚糖水凝胶中，方法简单且经济可行。通过扫描电子显微镜、流变学和差示扫描量热法对该水凝胶进行表征。结果表明，该水凝胶具有光滑的表面、热响应行为和良好的机械稳定性。含有GSNO的PL/CS水凝胶在NO释放和GSNO扩散的动力学实验证明，在适合生物医学应用的浓度下持续释放NO/GSNO，并且未发现释放NO的水凝胶在具有抗菌作用的浓度范围对Vero哺乳动物细胞有毒。因此，GSNO-PL/CS水凝胶是局部递送NO的合适生物材料，可用于伤口愈合、抗菌等方面。

碱性化学灼伤可引起角膜的氧化损伤，这可能导致视力丧失或失明。Tsai等[35]研究表明，外源性天然抗氧化剂可能是角膜伤口愈合的潜在治疗方法，然而，眼部生物利用度低和停留时间短是局部施用抗氧化剂的限制因素。阿魏酸(FA)是一种天然酚类化合物，是一种极好的抗氧化剂。他们研究FA在氧化应激下角膜上皮细胞(CECs)中的作用，并评价使用含有FA的热敏壳聚糖水凝胶进行角膜伤口愈合的可行性。结果表明，含有FA的水凝胶可以降低CECs的炎症水平和细胞凋亡。在兔角膜碱烧伤模型中，加载FA的水凝胶可促进角膜伤口愈合。由此表明，负载FA的水凝胶可能在治疗角膜碱烧伤中具有潜在的应用价值。

4 总结与展望

随着医疗服务水平的提高，人们对创伤修复敷料的要求也越来越高。水凝胶独特的生物化学性质和三维网络结构为生物医学领域提供了广泛的应用，包括局部药物输送、组织工程、药物缓释等。壳聚糖因具有创伤修复、止血、抑菌等性能而使壳聚糖基水凝胶成为研究的一个热点，但是CS水凝胶的成胶时间、机械性能、药物释放等还很难进行精准控制，从而达到实际满足人体需要的智能水平。因此，进一步提升水凝胶的相关性能，实现相对精准的控制，是今后研究的方向。同时，壳聚糖基水凝胶大多数基于胶原蛋白、纳米纤维、多肽等用于控制释放或细胞增殖、分化而开发的，其显示出作为药物基质的巨大潜力，有待进一步的去研究与开发。