无抗日粮中添加肠杆菌肽对仔猪生长性能和粪便微生物的影响

2019-02-28熊海涛刘扬科张志华董文听谯仕彦

中国畜牧杂志 2019年2期

熊海涛，刘扬科，张志华，董文听，谯仕彦，张江

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.林州中农颖泰生物肽有限公司，农业部饲用抗生素替代技术重点实验室，河南林州 456550；3.大同海关，山西大同 037004；4.国家饲料工程技术研究中心，北京100193）

腹泻是仔猪生长受阻和死亡的重要原因，腹泻引起的死亡占仔猪死亡率的50%以上，每年给广大生猪养殖从业者造成的直接经济损失达数十亿元，防治仔猪腹泻一直是备受关注的世界性问题。引起仔猪腹泻的原因众多，致病性细菌感染是重要原因之一，其中最常见的是大肠杆菌和沙门氏菌[1]。预防治疗仔猪腹泻的传统方法是在饲料中添加抗生素，但近年来随着抗生素的禁用，寻找抗生素替代品用于饲料中预防细菌性腹泻已成为大势所趋。

肠杆菌肽是1992年Raul等[2]发现的由21个氨基酸构成索套结构的抗菌肽，其分子量为2.1 ku，N端的8个氨基酸通过内酰胺键形成环状结构，9～21氨基酸形成β发夹结构贯穿于环状结构内。许多研究表明，肠杆菌肽对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、沙门氏菌等）具有明显的抑制作用[3]。本试验在哺乳仔猪和保育仔猪无抗日粮中添加肠杆菌肽，以探讨肠杆菌肽对哺乳仔猪和保育仔猪生长性能、腹泻率以及粪便中微生物的影响，为肠杆菌肽替代抗生素预防仔猪腹泻提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料本试验所使用的0.5%肠杆菌肽由林州中农颖泰生物肽有限公司生产提供。

指示菌大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）标准菌株ATCC25922购自于ATCC微生物菌株保藏中心，大肠杆菌野毒株AZ1、沙门氏菌野毒株sk226和沙门氏菌野毒株1791由国家兽药评价中心提供，大肠杆菌W1和大肠杆菌W2分别是从腹泻仔猪粪便分离的对硫酸粘杆菌素和庆大霉素耐药的菌株。

1.2 牛津杯试验方法根据美国临床实验室标准化协会推荐的测定抗菌药物对指示菌的最小抑菌浓度（MIC）方法[4]，接种菌量为5×106CFU/mL，牛津杯放入铺有琼脂的平板上，倒入含有指示菌的LB培养基，配置琼脂LB培养基双层平板，待凝固后，取出牛津杯，在牛津杯孔中分别加入200 μL的不同浓度的肠杆菌肽溶液。37℃培养箱培养12 h，游标卡尺测量平板中的抑菌圈直径。

1.3 试验动物及日粮试验选用杜×长×大三元杂交仔猪，参照美国NRC（1998）哺乳仔猪和保育猪的营养需要配合成粉状全价料，基础日粮配方及营养成分见表1。

表1 基础无抗日粮组成及营养成分（风干基础）

1.4 试验设计与饲养管理选择日龄相同的4窝哺乳仔猪，随机分为2组，每组2窝，每窝10头仔猪，利用生长性能测定系统测定每头仔猪生长性能，对照组饲喂无抗基础日粮，试验组饲喂无抗基础日粮+肠杆菌肽（300 mg/kg），哺乳阶段仔猪试验期从5日龄至26日龄断奶，保育阶段仔猪试验从27日龄至79日龄。试验在菲律宾国际种猪繁育中心（International Training Center on Pig Husbandry）进行。

3日龄时对每头试验仔猪打耳标，便于生长性能自动测定系统识别，注射200 mg右旋糖酐铁补铁，同时对每头仔猪进行阉割去势。试验期间，根据仔猪生长的不同阶段设定生长性能自动测定系统的参数；每天记录仔猪的采食、饮水和增重情况，计算耗料增重比，观察记录腹泻情况；保持猪舍的通风清洁，做好猪舍的清扫消毒工作；免疫程序按照正常饲养管理程序进行。

1.5 粪便微生物计数试验结束时（26日龄和79日龄时）采集仔猪粪便，取0.1 g粪便加入1 mL PBS，震荡、离心后，PBS梯度稀释后，采用平板活菌计数的方法[5]进行细菌计数。大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板（青岛海博生物技术有限公司）上培养，沙门氏菌在SS琼脂平板（青岛海博生物技术有限公司）上培养，37℃恒温培养18～24 h观察计数，结果以每克粪便中菌落数量表示。

1.6 统计分析结果以平均值±标准差表示，数据处理与分析采用SPSS 20.0软件中单因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 肠杆菌肽的体外抑菌试验肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌结果见表2。肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌标准菌株和野毒株增殖均有明显的抑制作用，且具有剂量依赖效应，随着肠杆菌肽浓度的变大，其抑菌圈直径不断变大。对大肠杆菌ATCC25922菌株，肠杆菌肽浓度为300 μg/mL时有明显的抑菌圈，肠杆菌肽浓度为200 μg/mL时抑菌圈消失，表明肠杆菌肽对大肠杆菌ATCC25922的MIC为300 μg/mL，肠杆菌肽对大肠杆菌AZ1、大肠杆菌W1和W2的MIC均为200 μg/mL，肠杆菌肽对沙门氏菌SK226和沙门氏菌1791的MIC均为100 μg/mL。综上所述，肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC在100～300 μg/mL。

2.2 肠杆菌肽对仔猪生长性能的影响由表3可知，在哺乳阶段，与对照组相比，无抗日粮中添加肠杆菌肽使哺乳仔猪断奶末重提高15.6%（P＜0.05），断奶增重提高21.9%（P＜0.05），断奶平均日增重提高22.7%（P＜0.05），哺乳阶段仔猪腹泻率降低74.1%（P＜0.05）。在保育阶段，与对照组相比，无抗日粮中添加肠杆菌肽使保育仔猪末重提高27.5%（P＜0.05），保育增重提高33.0%（P＜0.05），平均日增重提高33.3%（P＜0.05），保育仔猪平均日采食量提高19.3%（P＜0.05），保育仔猪耗料增重比降低10.4%（P＜0.05），保育阶段仔猪腹泻率降低66.0%（P＜0.05）。

表2 肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径 mm

表3 肠杆菌肽对哺乳阶段仔猪和保育阶段仔猪生长性能的影响

2.3 肠杆菌肽对仔猪粪便大肠杆菌和沙门氏菌数量的影响如表4可知，与对照组相比，日粮中添加肠杆菌肽可以显著降低哺乳仔猪粪便中大肠杆菌和沙门氏菌数量（P＜0.05），显著降低保育仔猪粪便中大肠杆菌数量（P＜0.05），减少沙门氏菌数量（P＞0.05）。

3 讨论

表4 肠杆菌肽对哺乳仔猪和保育仔猪粪便微生物数量的影响

3.1 肠杆菌肽的体外抑菌试验结果抗菌肽具有广谱的抗细菌、真菌、病毒等功效[6]，肠杆菌肽是一种针对革兰氏阴性菌的抗菌谱较窄的抗菌肽，对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌和沙门氏菌）有极其良好的杀伤作用。Lope等[7]研究发现，肠杆菌肽对沙门氏菌的MIC为3.12 μg/mL。Sable等[8]研究表明，肠杆菌肽对多种大肠杆菌标准菌株和临床分离野毒株均有抑制杀灭作用，对大肠杆菌O157:H7的 MIC 为 1 μg/mL。Portrait等[9]研究表明，肠杆菌肽对多种沙门氏菌菌株具有抑制杀灭作用。这些研究均表明肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌具有很强的抑菌效果。Rintoul等[10]研究表明，肠杆菌肽是通过破坏细菌细胞膜的完整性和抑制RNA转录2种机理来抑制大肠杆菌和沙门氏菌。本试验结果与上述结果一致，即肠杆菌肽可以在体外抑制大肠杆菌和沙门氏菌标准菌株和野毒株的增殖。

3.2 肠杆菌肽对仔猪生长性能的影响本试验表明，无抗日粮中添加300 mg/kg肠杆菌肽显著提高了哺乳仔猪和保育仔猪的平均日增重，降低保育仔猪的耗料增重比，这说明肠杆菌肽有利于仔猪对营养物质更好地消化吸收。已有研究表明，抗菌肽可以通过杀灭肠道致病菌、调节肠道微生物菌群平衡、改善肠道绒毛形态来增强肠道对营养物质的吸收，进而提高生长性能[9]。日粮中添加抗菌肽可以提高仔猪[11-13]和肉鸡[14]的生长性能。张江等[15]研究表明，肠杆菌肽可以提高断奶仔猪的平均日增重和饲料利用效率。孙何军等[16]研究表明，肠杆菌肽可以提高蛋鸡的生产性能。

在哺乳和保育阶段的仔猪极易受革兰氏阴性菌感染引起腹泻，如大肠杆菌和沙门氏菌。研究表明，日粮中添加抗菌肽可以降低仔猪[12,17]和肉鸡[18]的腹泻率。本研究体外试验结果表明，肠杆菌肽可以抑制杀灭大肠杆菌ATCC25922、AZ1、W1和W2，沙门氏菌sk226和1791，可以显著降低哺乳阶段仔猪和保育阶段仔猪的腹泻率。

3.3 肠杆菌肽对仔猪粪便大肠杆菌和沙门氏菌数量的影响动物肠道内的微生物区系平衡对于维持肠道的功能具有重要作用[19]。日粮中添加抗菌肽可以增强动物对病原性微生物的抵抗能力[20]。已有研究表明，抗菌肽可以抑制肠道有害微生物（如大肠杆菌）的数量并提高仔猪健康水平[21-23]。Choi等[18]研究表明，日粮中添加抗菌肽可以降低蛋鸡肠道中大肠杆菌数量。本试验结果亦表明，肠杆菌肽可以降低哺乳仔猪和保育仔猪粪便中的大肠杆菌和沙门氏菌数量。结合肠杆菌肽在体外能抑制杀灭大肠杆菌和沙门氏菌的试验结果，肠杆菌肽可能是通过抑制杀灭肠道中致病性的大肠杆菌和沙门氏菌，进而降低哺乳仔猪和保育仔猪腹泻率，从而提高仔猪的生长性能。