灭菌方法和培养基质对沙氏鹿茸草种子发芽的影响

郎晓平，孙健，沈晓霞，江建铭，王志安

(1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053； 2.浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

沙氏鹿茸草(MonochasmasavatieriFranch.)为玄参科鹿茸草属多年生草本植物，广泛分布于我国华南地区的浙江、江西、湖南、贵州等省份。全草入药，具有清热解毒之功效，常用于感冒、咳嗽、赤痢、便血、风湿骨痛、牙痛和乳痈等症的治疗，收录于浙江省炮制规范。目前，有关研究主要集中于沙氏鹿茸草的有效成分分析[1-3]、种子的去休眠[4]、组培苗的愈伤诱导与培养[5-6]等方面。沙氏鹿茸草的组培灭菌方法主要为消毒液灭菌，如用升汞、NaClO溶液和乙醇处理蒴果。然而，成熟的沙氏鹿茸草蒴果容易开裂，即使未开裂的蒴果经4 ℃储藏1个月后变得脆而硬，后续的接种操作困难，因此，探索了剥离种子气体灭菌的方法。愈伤组织诱导和组培苗培养是优异沙氏鹿茸草种苗快速繁育的重要手段，已有的研究均以成熟植株营养体器官诱导愈伤组织，存在污染率高、成活率低、愈伤组织诱导率低等问题，为此，作者探索了无菌种苗的组培条件，以便为后续的幼苗愈伤组织的诱导提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

未完全成熟的沙氏鹿茸草种子，2017年6月19日采集于浙江省丽水市缙云县的同一自然群体，并于4 ℃冰箱保存。

1.2 处理设计

1.2.1 气体灭菌

将沙氏鹿茸草的蒴果剪开，剥离蒴果内种子。种子用滤纸包裹，置于5 L密封皿中，取5%NaClO溶液80 mL于100 mL烧杯中，加入3 mL浓盐酸，分别处理1、2、3和4 h。处理后的种子，接种于含有20 g·L-1蔗糖的1/2MS培养基上，每瓶接种20粒种子，于25 ℃、光照强度1 500～2 000 lx、光照12 h的条件下培养。接种后21 d统计沙氏鹿茸草种子的萌发和染菌情况。

1.2.2 基质设置

设置7种培养基组别(表1)进行试验。氯气灭菌3 h，接种后至28 d记录不同培养基上沙氏鹿茸草种子的萌发和染菌情况。

1.2.3 抑菌剂处理

选取腈菌唑为沙氏鹿茸草的抑菌剂，以控制接种染菌率，同时考查不同浓度腈菌唑对沙氏鹿茸草种子萌发与生长的影响。在20 g·L-1蔗糖的1/2MS基础培养基上添加25%的腈菌唑，最终浓度分别为0(CK)、50(A)、100(B)、200(C)、300 μL·L-1(D)，氯气灭菌3 h后接种，接种后的18和23 d观察种子的发芽率与污染率，其他试验方法同1.2.1节。

1.3 统计与分析

污染率=污染瓶数/总瓶数×100%；发芽率为随机选取12瓶未污染的组培瓶，统计发芽率和相关性状。使用SPSS 18.0软件(IBM，USA)对数据进行单因素方差分析，处理间差异性分析使用最小显著差数法(LSD)，P≤0.05为显著水平。

表1 不同培养基组别的组成

2 结果与分析

2.1 氯气灭菌体系优化

表2所示，随着氯气处理时间的延长，沙氏鹿茸草种子的组培污染率明显降低，处理3 h污染率下降至15.0%。随氯气处理时间加长，沙氏鹿茸草发芽率呈现明显下降趋势，处理间差异显著，说明氯气对沙氏鹿茸草种子具有一定毒害作用。本试验体系下，氯气处理3 h是较优的灭菌方案，具有较高的发芽率，并且可以较好地控制污染率。

表2 不同氯气处理时间的种子发芽率和污染率

注：同列无相同小写字母表示处理间差异显著(P≤0.05)。表3～5同。

2.2 基质对沙氏鹿茸草种子发芽的影响

接种后3～7 d，染菌现象开始出现，7 d后染菌现象不再增加。土壤基质经过灭菌后仍然具有较高的污染率(表3)，该现象可能与土壤基质富含有机质、灭菌不彻底有关。接种后12 d，Z1、Z2、Z3、Z1、Z2组均萌发长出2片幼叶，而CK与S组萌发较慢，多数种子仅种皮开裂，未长出绿色叶片。接种后14 d，各组处理多数种子萌发，并长出1条主根及2片嫩绿色叶片，苗高2.8～4.9 mm(表4)，根长2～4 mm，S组种子萌发较少，未萌发的种子多数有发芽迹象。接种后21 d，各组种子均完成萌发，开始进入生长阶段，未萌发的种子无萌发迹象，不会再萌发。接种后28 d，已萌发的种子开始长出4片绿叶，叶片颜色加深，形状变大且更为细长，苗高7.4～12.5 mm。

表3 不同培养基组别的种子发芽特征

从表3看出，CK、T1、S组的发芽率显著低于Z1、Z2、Z3、T2的发芽率，其中S组(土壤处理)发芽率最低。Z3与T2的发芽率较高，而T2、Z1、Z2、Z3之间发芽率无显著差异，初步证明蔗糖对沙氏鹿茸草的萌发有一定的促进作用，活性炭不影响种子萌发。当蔗糖浓度达到30 g·L-1，污染率呈现降低趋势，同时，活性炭能在一定程度上减少培养基的污染。由表4可知，土壤组生长最为缓慢，加入蔗糖的Z1、Z2、Z3、T2组生长显著快于CK、T1、S组，T2组幼苗显著高于其他处理。

表4 不同培养基组别的幼苗发育特征

2.3 抑菌剂对沙氏鹿茸草种子发芽的影响

分别在接种后18与23 d观察沙氏鹿茸草种子的发芽率与污染率，结果(表5)2个时间点污染率没有变化。

从表5可知，随着腈菌唑浓度的增加，沙氏鹿茸草的发芽率有下降的趋势，CK组的发芽率为66.0%。未加腈菌唑组多数在12～14 d发芽，而加入腈菌唑后发芽时间明显推迟，尤其是腈菌唑浓度为300 μL·L-1的D组，发芽时间推迟到接种后20 d 左右，说明腈菌唑对于沙氏鹿茸草的萌发有抑制作用。腈菌唑的添加使得鹿茸草的染菌情况有所抑制，污染率随腈菌唑浓度的上升而下降，两者呈负相关，但其抑菌效果并不突出，与对照组无显著差异。从苗高的数据可以看出，腈菌唑处理对幼苗生长有明显抑制作用，表现为生长受抑制，苗高显著降低，且叶片变小、颜色加深。因此，培养基中添加腈菌唑不能起到显著的抑菌作用，反而会抑制种子的萌发和幼苗的生长。

表5 不同浓度腈菌唑处理组别的种子发芽率和污染率

3 小结与讨论

为防止沙氏鹿茸草蒴果成熟后开裂，供试种子在未完全成熟时采收，会存在部分未成熟种子，因此沙氏鹿茸草的种子发芽率在80%左右。目前，外植体和种子灭菌方法主要是液体灭菌和气体灭菌，具体包括升汞、次氯酸钠和氯气处理等。已有研究表明，氯气灭菌对种子的毒害作用较小[7]。本试验体系下，氯气灭菌后发芽率下降至60%～70%，可以满足后续试验需求。沙氏鹿茸草发芽培养基质的研究表明，蔗糖和MS培养基中的营养物质有利于种子的萌发和生长[8]，且20 g·L-1以上的蔗糖浓度才能保证沙氏鹿茸草的快速生长。腈菌唑是广谱杀菌剂，热稳定性较好，可以抑制真菌麦角甾醇的生物合成，农业生产中对子囊菌、担子菌等均具有较好的防治效果，常用于种子包衣剂[9]。本试验中，高浓度的腈菌唑对于沙氏鹿茸草幼苗表现出明显的毒害作用，300 μL·L-1处理的污染率为13.3%。一方面，一个组培瓶中只要有一粒种子灭菌不完全就会导致真菌或细菌污染；另一方面，该现象可能是由无法彻底灭菌的种子内生菌引起[10]，长势强壮的T2和Z3组具有较低的污染率可以间接证明这一推测[11]。综上所述，经过氯气灭菌3 h后，20 g·L-1蔗糖的1/2MS培养基可以满足沙氏鹿茸草的萌发和生长需求。