贝类样品砷含量的测定方法

孟庆辉，黎飞，何辉，周翔

(浙江省水产技术推广总站，浙江 杭州 310023)

砷(As)是自然界广泛存在的有毒非金属元素，易通过水、食物等途径被人体摄入[1]。作为国际癌症研究所(IARC)等权威机构公认的人类致癌物，无机砷进入人体能够对肠胃道、肝脏、肾脏、神经系统、心血管系统、血液系统、呼吸系统等产生毒性，具有致畸或致突变效应[2]。砷元素毒性不仅与含量有关，还与形态相关。无机砷毒性远大于有机砷，砷与有机基团结合越多，毒性越小。一般砷化物毒性：亚砷酸(As Ⅲ)>砷酸(As Ⅴ)>一甲基砷酸(MMA)>二甲基砷酸(DMA)>砷甜菜碱(AsB)>砷胆碱(AsC)，此外还有砷糖、砷脂等[3]。

海产品是人们日常生活中食品的重要组成部分。海产品，特别是贝类，砷元素含量较高。不少研究表明，海产品贝类等的砷主要是毒性较小的有机砷，且基本以砷甜菜碱和砷胆碱形式存在，也存在一些结构更复杂的砷糖、砷脂类化合物等[4-5]。在砷形态含量分析方面，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)由于灵敏度高、分离效果好，而得到大面积应用。贝类样品的HPLC-ICP-MS检测前处理过程，一般采用甲醇-水提取体系，但贝类样品中含有大量的脂肪，而脂肪是疏水性化合物，而且有机态砷又分为水溶性砷和脂溶性砷；因此，在砷形态分析过程中，如何有效提取不同形态的砷，并保持其化学形态不变，是砷形态检测分析的关键。本文对HPLC-ICP-MS检测贝类样品砷形态的前处理过程进行分析，并对浙江沿海贝类砷含量及砷的存在形态等问题进行初步讨论。

1 材料与方法

1.1 材料

泥蚶(Tegillarcagranosa)、贻贝(Mytilusedulis)、缢蛏(Sinonovaculaconstricta)、青蛤(Cyclinasinensis)、彩虹明樱蛤(学名虹光亮樱蛤，Moerellairidescens)、香螺(NeptuneacumingiCrosse)、东风螺(Babyloniaareolata)等7种浙江沿海常见贝类，采集于台州三门、温岭，温州平阳、乐清等地。

湿样采集后，冷藏保存，到实验室后立即取肉，利用不含重金属的匀浆机匀浆，-20 ℃保存。干样由样品真空浓缩冷冻干燥机制取，取足够多的湿样样品，放在冷冻干燥机中干燥，彻底去除水分后，研磨杵研磨成粉状，-20 ℃保存备用。

一甲基砷(MMA)溶液标准物质(GBW08669)、二甲基砷(DMA)溶液标准物质(GBW08668)、砷甜菜碱(AsB)溶液标准物质(GBW08670)、砷胆碱(AsC)溶液标准物质(GBW08671)、砷酸根(As5+)溶液标准物质(GBW08667)、亚砷酸根(As3+)溶液标准物质(GBW08666)等，采购自中国计量科学研究院。阿散酸(ASA)标准品(证书编号cas：98-50-0)、硝苯砷酸(NS)标准品(证书编号cas：98-72-6)、洛克沙(RxS)标准品(证书编号cas：121-19-7)等，采购自DR.Ehrenstorfer公司。扇贝成分分析标准物质(GBW10024)采购自国家标准物质中心。硝酸(优级纯)采购自苏州晶瑞，甲醇(色谱级)采购自美国TEDIA。0.45 μm过滤柱(津隆牌)采购自天津科亿实验设备有限公司。

Milli Q Advantage A10超纯水仪，上海科导SK-15GT超声仪，德国赛多利斯 BS210S电子天平，美国Beckman Coulter Allegra X-12离心机，屹尧科技Preekem TOPEX微波消解仪，屹尧科技Preekem G-400赶酸仪，美国LABCONCO真空浓缩冷冻干燥机，Thermo Fisher iCAP Qc ICP-MS，戴安U-3000 HPLC。

1.2 砷萃取

为测定贝类样品中砷的元素形态，针对贝类样品特点，采用5种前处理方法：方法1，以超纯水作为提取剂，称取样品1.0 g于50 mL离心管中，加入40 mL的超纯水混匀后，超声萃取1 h，8 000 r·min-1离心30 min，取上清液过0.45 μm滤膜于5 mL离心管中，4 ℃冰箱静置10 min，取上清液上机分析；方法2，以超纯水、甲醇体积比1∶2溶液作为提取剂，称取样品1.0 g于50 mL离心管中，加入15 mL的超纯水、30 mL的甲醇溶液混匀后，超声萃取1 h，8 000 r·min-1离心30 min，取上清液过0.45 μm滤膜于5 mL离心管中，4 ℃冰箱静置10 min，取上清液上机分析；方法3，以超纯水、甲醇体积比1∶1溶液作为提取剂，称取样品1.0 g于50 mL离心管中，加入20 mL的超纯水、20 mL的甲醇溶液混匀后，超声萃取1 h，8 000 r·min-1离心30 min，取上清液过0.45 μm滤膜于5 mL离心管中，4 ℃冰箱静置10 min，取上清液上机分析；方法4，以超纯水、甲醇体积比2∶1溶液作为提取剂，称取样品1.0 g于50 mL离心管中，加入30 mL的超纯水、15 mL的甲醇溶液混匀后，超声萃取1 h，8 000 r·min-1离心30 min，取上清液过0.45 μm滤膜于5 mL离心管中，4 ℃冰箱静置10 min，取上清液上机分析；方法5(对照)，以超纯水、乙酸体积比19∶1溶液作为提取剂，称取样品1.0 g于50 mL离心管中，加入38 mL的超纯水、2 mL 3%乙酸溶液混匀后，超声萃取1 h，8 000 r·min-1离心30 min，取上清液过0.45 μm滤膜于5 mL离心管中，4 ℃冰箱静置10 min，取上清液上机分析。

1.3 贝类中总砷含量分析

采用微波消解法[6]测定样品中总砷。称取1.0 g样品于消解罐中，加入5 mL硝酸、1 mL过氧化氢。将消解罐放入微波消解系统中消解，消解完全后赶酸，待酸雾消失、消解液剩余约0.5 mL后，将消解液转移至50 mL比色管中，用超纯水清洗数次消解罐，合并液体到比色管中，定容到50 mL，摇匀后静置。同时，做空白及扇贝质控。用ICP-MS测定溶液中总砷的含量。

采用湿法消解测定样品中总砷。称取1.0 g样品于聚四氟乙烯管中，加入15 mL硝酸、4 mL高氯酸、1.25 mL硫酸，静置3 h，放在电热板上200 ℃加热，待样品残渣消解完全，继续加热直至酸雾散尽，继续加热赶酸，定容到50 mL比色管中。同时，做空白及扇贝质控。用ICP-MS测定溶液中总砷的含量。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2010对数据进行统计及初步分析，运用SPSS 16.0做单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 贝类总砷含量

如表1所示，微波消解法测定的7种贝类总砷含量为2.21～8.77 mg·kg-1，不同种类的贝类总砷含量差别较大。东风螺总砷含量最高，其次是香螺、缢蛏和泥蚶，而彩虹明樱蛤、贻贝等品种总砷含量较低。湿法消解测定的7种贝类总砷含量为3.59～14.25 mg·kg-1，相对含量次序与微波消解法一致。

表1 微波消解和湿法消解测定的贝类总砷含量 mg·kg-1

实验同时测定了扇贝成分分析标准物质中总砷含量，湿法消解测定含量为4.1 mg·kg-1，微波消解测定含量为3.04 mg·kg-1，标准值为(3.6±0.6)mg·kg-1。整体来看，两种方法的测定结果均在标准值范围内，但微波消解法测定的含量略低。

2.2 不同萃取方法的砷含量

如表2所示，不同前处理方法对不同贝类的萃取效率不同：缢蛏、贻贝、泥蚶、彩虹明樱蛤、香螺、东风螺等用方法2做前处理时萃取效率最高，青蛤用方法3做前处理时萃取效率最高。整体来看，方法2和方法3的萃取效率较高，方法1与方法5的萃取效率较低。7种贝类添加甲醇提取的前处理方法(方法2～4)测定的砷元素含量，除香螺方法3外，均高于微波消解和湿法消解。另外，7种贝类最高萃取效率下测定的砷含量由高到低依次为东风螺>泥蚶>香螺>缢蛏>青蛤>贻贝>彩虹明樱蛤，与7种贝类砷消解含量次序不一致。

表2 不同前处理方法测定的贝类砷含量 mg·kg-1

2.3 贝类样品中砷形态

利用HPLC-ICP-MS测定贝类样品中砷主要成分，缢蛏、贻贝等贝类样品砷主要成分为砷甜菜碱，此外还有少量的二甲基砷、砷胆碱、硝苯砷酸等，无机砷含量较低(图1和2)。与其他研究结果相近[5,7-8]。

图1 缢蛏砷形态分析

图2 贻贝砷形态分析

3 小结与讨论

不同贝类的总砷含量存在差异，在环境中对砷的吸收、排泄和富集能力亦不同。本次测定的7种贝类，东风螺、香螺、缢蛏、泥蚶等总砷含量较高，贻贝、彩虹明樱蛤、青蛤等总砷含量相对低一些。这可能与其养殖和生长环境有关。钟硕良[9]研究指出，福建沿海滩涂养殖底栖贝类总砷平均含量要高于浅海筏式养殖的贝类。不同生长环境下，不同贝类滤水摄食及体内富集情况不同，会导致不同贝类体内总砷含量存在差异。在消解过程中，可能是由于不同贝类样品基质有差别，在同样消解方法中，总砷消解率并不相同。

贝类砷形态主要以有机砷砷甜菜碱(AsB)为主，砷甜菜碱是贝类样品中砷最主要的存在形式。Cullen等[10]认为，砷甜菜碱化学性质属于惰性，无毒且能够被迅速排泄，不会对人体造成伤害。在贝类砷元素研究和评价过程中，区分出无机砷和有机砷化合物，区分出有毒的砷形态(如三价砷、五价砷)与无毒的砷胆碱、砷甜菜碱、砷糖等具有重要意义。

甲醇-水是海产品中运用最广的砷萃取方法，甲醇、水体积比1∶1是应用最多的组合，这种处理方法不改变原有砷的形态，可避免不同形态砷转化带来的测定偏差。但结合本实验，这一比例并不

是除青蛤外其他6种贝类砷形态分析的最优前处理方法，对于缢蛏、贻贝、泥蚶、彩虹明樱蛤、香螺、东风螺等，超纯水、甲醇体积比1∶2才是萃取效率最高的方法。用甲醇-水体系进行ICP-MS分析时，由于电感耦合等离子体质谱对有机溶剂进样含量要求比较低，需要对提取液进行蒸发浓缩或者进行一定比例的稀释才能上机检测，这些操作要么过程比较复杂，要么会增加实验系统误差。超纯水、水-乙酸体系进行样品提取前处理与甲醇-水体系提取一样，可以保持砷形态的一致性，虽然萃取的效率并不很高，但方法简单，不需要蒸发浓缩稀释等步骤即可直接上机分析操作。在实际检测过程中，可以根据样品对象特征、检测分析要求及实验条件等选择不同的前处理方法。

在总砷消解测定结果上，微波消解贝类总砷测定值明显低于湿法消解，且这两种消解方法整体低于有机溶液萃取的砷元素含量。主要原因：一是从实验结果可知，贝类样品中砷存在的主要形式是砷甜菜碱、二甲基砷、砷胆碱等有机砷，这些有机砷化合物性质稳定，不易消解成砷离子；二是这两种消解方法消解温度都低于200 ℃，微波消解更是只有185 ℃，而消解复杂有机砷化物必须保持消化强度的高氧化性和高沸点，微波消解只用硝酸和过氧化氢，简单的消解酸体系使总砷消解效率进一步降低，湿法消解温度可以达到200 ℃，且消解酸体系使用高氯酸和硫酸等强氧化剂，因而效果好于微波消解。实验过程中，扇贝成分分析标准物质由于是加工后状态，且可能在标准物质制备过程中加入的都是无机砷，因此在消解过程中比较容易达到高的消解效率，这与李慧等[11]研究结果相同。干法消解过程中的马弗炉灰化等步骤能更好地分解包含水分、粗蛋白、脂肪、灰分、沉积物及藻类杂质等复杂贝类样品，充分解离有机砷化合物。关于其在检测贝类砷含量方法的效果还有待于进一步研究。