2005年和2015年结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药水平的变化

文舒安，张婷婷，霍凤敏，尚媛媛，梁 倩，薛 毅，李云絮，王 芬，逄 宇，黄海荣

结核病是全球十大死因之一，是高于包括艾滋病在内的传染病的头号杀手，2016年全球约有167万人死于结核病。据WHO《2016全球结核病年报》估算，我国耐多药结核病患者数居世界第二位[1]。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，全国总耐药率为42.1%，耐多药率为6.8%，广泛耐药率为2.1%[2]。因此，控制耐药和耐多药(MDR)结核病的流行已经成为中国结核病防治工作的迫切任务。

乙胺丁醇(ethambutol，EMB)是1961年开始应用在结核病治疗上的一种人工合成的具有广谱抗分枝杆菌活性的一线抗结核药物。2010年全国第5次结核病流行病学抽样调查结果显示，280株结核分枝杆菌复合群菌株对EMB的耐药率为6.8%[1]，且在以往的研究表明，在我国的某些地区耐多药结核同时表现出对EMB耐药的有50.5%～66.7%。因此，建立快速准确的EMB耐药检测方法对于选择有效的结核治疗方案至关重要，而了解EMB耐药相关基因的突变特征可为建立快速诊断方法提供分子基础。

1 材料与方法

1.1研究对象 本研究的139株 MDR-TB(耐多药结核分枝杆菌)菌株来自北京胸科医院2005年和2015年就诊患者的临床分离株，所有菌株均经对硝基苯甲酸(PNB)抑制生长试验鉴定为结核分枝杆菌。

1.2试剂仪器 药敏试验所用乙胺丁醇购买于Sigma公司，营养添加剂OADC购买于美国BD公司，罗氏培养基购买于珠海银科公司，96孔板购买于美国Costar公司，阿尔玛蓝(Alamar blue)购买于美国Bio-Rad公司

1.3药物敏感性测定 微孔板阿尔玛蓝显色法 (micro plate alamar blue assay, MABA)药敏试验：刮取罗氏培养基上生长4周左右的新鲜菌落置于磨菌瓶中研磨均匀，稀释菌悬液并比浊至1麦氏，再以1∶20比例用7H9培养基稀释菌液。向预制含有不同浓度EMB的96孔板的每孔中加入100 μL菌液，37 ℃培养7～9 d，再向微孔板中加入20 μL阿尔玛蓝和50 μL 5% Tween-80的预混显色液，37 ℃继续培养24 h后观察96孔板颜色变化。判定标准：蓝色孔为无菌生长，粉色孔为有菌生长，蓝色孔的最低药物浓度记为能抑制结核分枝杆菌生长的MIC。当MIC大于临界药物浓度时判断为耐药，反之则为敏感按照。定义EMB耐药界定浓度为EMB≥5.0 μg/mL，当5.0 μg/mL≤MIC≤20.0 μg/mL时，定义为低浓度耐药；当MIC≥40.0 μg/mL时，定义为高浓度耐药。

1.4核酸提取 用接种环刮取菌落置于加有0.5 mL生理盐水的EP管中，然后100 ℃水煮30 min，再13 000 r/min离心5 min，吸取上清大约500 μL存放于1.5 mL EP管中。

1.5目的基因扩增、测序及测序数据分析 PCR扩增采用的上下游引物分别为5′CTGACCGACGCCGTGGTGATAT3′ 和 5′TGAATGCGGCGGTAACGACG 3′。反应体系为：12.5 μL 2×Master MIX，上游引物和下游引物各0.5 μL，2 μL的DNA模板，10.5 μL去离子水。反应条件：预变性95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，总计35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物送北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果采用BioEdit软件与标准菌株H37Rv基因序列进行比对

1.6PCR产物经电泳鉴定后，进一步送睿博兴科公司测序。利用软件DNAstar Lasergene进行序列拼接和与embB基因标准序列的比对，分析突变位点。

1.7统计学处理 应用SPSS 22.0软件进行分析，比较2005年和2015年敏感和耐药菌株数两组间的差异分析采用完全随机设计的两样本率比较(卡方检验)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PCR产物电泳图 见图1。

*1号孔为100 bp marker，2-4,6-8号为PCR产物，5号孔为空白图1 PCR产物电泳图Fig.1 PCR product electropherogram

2.22005年和2015年结核病患者耐药情况之间的比较 2005年入选的63株MDR菌株对EMB耐药的有57株，其中低耐药菌株有40株，耐药率合计为70.18%；高耐药菌株有17株，耐药率合计为29.82%。2015年入选的76株MDR菌株中对EMB耐药的有71株,其中低耐药菌株有57株，耐药率合计为80.28%；高耐药菌株有14株，耐药率合计为19.72%。比较2005年和2015年敏感和耐药两组间的差异分析采用完全随机设计的两样本率比较(卡方检验)，没有统计学差异(χ2=0.410，P<0.05)。

2.3DNA测序结果 本研究发现2005年检测的63株MDR中有43株携带embB突变，突变位点共7种分别为ebmB306、ebmB319、ebmB328、ebmB330、ebmB354、ebmB405、ebmB406，其中常见的突变位点为embB306(26株，60.5%)和embB406(11株，25.6%)。2015年检测的76株MDR中有56株携带embB突变，检出位点共有6种ebmB297、ebmB306、ebmB319、ebmB354、ebmB405、ebmB406。

其中常见的突变位点为embB306(42株，75.0%)和embB406(6株，14.3%)。两年一共检测的139株MDR中有99株携带embB突变，占所有MDR的71.2%；未携带突变的有40株，占所有MDR的28.8%。其中有1株菌为双位点突变，其余株菌均为单位点突变。此外，还发现了2种未被记录入tbdreamdb MTB基因数据库的突变位点，分别为embB354(图2)和embB405(图3)。比较2005年和2015年突变类型的差异，分析采用群组卡方检验，没有统计学差异(χ2=9.410，P<0.05)。

图2 embB354(GAC/GCC)位点突变测序图Fig.2 embB354 (GAC/GCC) site mutation sequencing map

图3 embB405(GAG/GAC)位点突变测序图Fig.3 embB405 (GAG/GAC) site mutation sequencing map

2.42005年和2015年MDR基因突变与EMB药敏相关性分析 本研究的MDR中耐EMB菌株携带embB突变的比例为71.01%，野生型为29.0%。297位点突变有1种突变形式，为低水平耐药。306位点5种突变形式，后文详细分析。319位点共有4种突变形式，均为低水平耐药。328位点有2种突变形式，均为低水平耐药。330位点突变有1种突变形式，为高水平耐药。354位点有2种突变形式，低水平耐药率为66.7%,高水平耐药率为33.3%。405位点有2种突变形式，低水平耐药率为50.0%,高水平耐药率为50.0%。406位点有4种突变形式，主要与低水平耐药率相关(70.6%)(见表1)。

embB基因不同突变类型引起不同水平的对EMB耐药，306位点的突变中ATG/GTG (Met102Val) 这种突变形式所占比例最高，并且这种突变形式表现出对EMB低水平耐药，耐药率为50.0%。其他的4种突变形式ATG/ATA (Met102Ile)、ATG/ATC (Met102Ile)、ATG/ATT (Met102Ile)、ATG/CTG (Met102Leu)也主要表现与低水平耐药相关。

3 讨 论

乙胺丁醇作用于分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶，通过抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影响细胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-蛋白聚糖复合物的形成,引起细菌细胞壁结构改变，最终导致细菌死亡[3]。因与其他一线抗结核药有协同作用，且可延缓其他药物耐药性的产生，被普遍用于临床治疗，导致其耐药率高，对比2005年和2015年数据发现两年的耐药率有统计学差异，说明EMB在临床使用的普遍率。在其他研究中，MDR对EMB的耐药率为50.5%～66.7%[4-5]。而本研究中，MDR对EMB的耐药率为92.1%(128/139)，可能与我院是结核病专科医院，所收治的大多为反复治疗的病人，其耐药水平普遍偏高有关。其他国家如波兰，检测MDR中对EMB的耐药率为34.0%(17/50)[6]，低于我国水平。因此，我国的MDR患者确定用药方案前可先检测其embB基因突变情况。当MTB对EMB产生低浓度耐药时，可以通过提高药物的剂量以达到治疗的目的，对于高水平耐药的患者，可考虑换用其他药物治疗。

表1embB不同突变类型与EMB耐药水平的关系
Tab.1 Relationship between different types ofembBmutations and EMB resistance

突变位点碱基替换氨基酸改变样本数不同MIC(μg/mL)对应的样本数0.6251.252.55102040≥80embB297TCG→GCGSer→Ala100010000embB306ATG→GTGMet→Val440005121719ATG→ATAMet→Ile1700064304ATG→ATCMet→Ile300020001ATG→ATTMet→Ile200011000ATG→CTGMet→Leu200011000embB319TAT→GATTyr→Asp100010000TAT→TGTTyr→Cys200002000TAT→TCTTyr→Ser100001000TAT→AATTyr→Asn100010000embB328GAT→GGTAsp→Gly100000100GAT→TATAsp→Tyr100000100embB330TTC→GTCPhe→Val100000010embB354①GAC→GCCAsp→Ala300010101GAC→AACAsp→Asn100000001embB405①GAG→GACGlu→Asp200001001embB406GGC→GCCGly→Ala800015011GGC→GACGly→Asp600120003GGC→TGCGly→Cys100001000GGC→AGCGly→Ser200010100突变型合计--99001232823321野生型--40037106707合计--139038333430328

①未被记录入tbdreamdb MTB基因数据库的突变位点。

注：(1)其中一株菌为306位点和354位点的双突变，归类至306突变中；(2)Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：缬氨酸；Pro：脯氨酸；His：组氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：丝氨酸

还有大量研究MDR和embB基因突变的数据，一篇研究河南结核病embB基因突变的研究中报道MDR中携带embB基因突变的比率为86.2% (119/138)[7]；另一篇报道深圳市MDR中携带embB基因突变的比率为82.4%(42/51)[4]，也与之相似。本研究的MDR中耐EMB菌株携带embB突变的比例为71.01%，略低于河南和深圳，可能是由于本研究还纳入了2005年的63株MDR，2005年MDR中携带embB基因突变的比率为68.3%(43/63)。对比其他国家，一篇研究波兰MDR的文章中报道了对EMB耐药的MDR中携带embB突变的比率为76.5%(13/17)[6]，导致上述差异可能是由于embB基因的突变存在地区性差异。

在本研究中发现，对EMB敏感的菌株也可以发生embB基因突变，有一株MIC为2.5 μg/mL的菌株在embB406位点发生了突变。其他研究也有报道[7-8]。还有些报道描述了对EMB敏感的菌株在embB的306位点有突变[9-10]。有2个对EMB敏感的分离株中embB306位密码子存在突变的解释：推荐用于药物敏感性试验的EMB浓度取决用于敏感性测试的表型方法，其范围为2～7.5 μg/mL(EMB)；可能由于这类embB306位密码子存在突变的分离株的MIC接近EMB耐药的界定浓度。推测在406位密码子存在突变的原因与之相类似。

本研究发现了2种未被记录入tbdreamdb MTB基因数据库的突变位点embB354和embB405。其中第354位发现有天冬氨酸突变为丙氨酸和天冬酰胺这两种突变形式，以天冬氨酸突变为丙氨酸占比多(75%)，3株菌株中2株为低水平耐药，1株为高水平耐药。天冬氨酸为极性带负电荷的氨基酸，而丙氨酸为非极性氨基酸，因此两种氨基酸存在较大的差异，导致EMB靶标embB结构的显著改变，从而影响了MIC。此外，这2种突变位点在其他研究中也有相关报道[11-12]，提示需要根据新报道的文献对tbdreamdb MTB基因数据库进行更新调整。

利益冲突：无