尤瑞克林对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12表达的影响

林冬融 揭育东 韩江全

脑梗死是中老年人常见病及多发病，其致残率高，严重影响患者的生活质量。细胞凋亡已被公认是脑梗死众多发病机制中的重要一环，以凋亡为主要病理变化的脑缺血半暗带面积大小直接决定患者预后。近年来研究表明细胞凋亡亦是糖尿病加重脑缺血再灌注损伤的重要机制之一[1]。尤瑞克林即人尿激肽原酶，是我国科研工作者研发的一种治疗急性缺血性脑血管病药物，它可以选择性扩张缺血区脑血管，减轻神经细胞损伤，抑制神经细胞凋亡以及促进内源性神经再生[2]。本研究通过动物实验模拟糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的病理生理过程，探讨尤瑞克林对糖尿病合并急性脑缺血再灌注损伤神经细胞的保护机制。

1 材料和方法

1.1实验动物与分组选取8周龄健康雄性SD大鼠82只，体重250～300 g，购自广东省医学实验动物中心。大鼠置室温25℃，洁净通风环境下饲养。以简单随机数字法分为尤瑞克林组(n=36只)、缺血组(n=36只)和假手术组(n=10只)，尤瑞克林缺血组和缺血组再随机分为脑缺血2 h再灌注12、24和48 h亚组，每亚组12只。

1.2方法

1.2.1糖尿病模型制作：SD大鼠均于实验前8 h禁食，6 h禁水。术前30 min新鲜配制浓度为5 mg/mL无菌链脲佐菌素(STZ)溶液。常规消毒后，按体重2 mg/100 g给予大鼠左下腹腔注射STZ，24 h后再次按体重3.5 mg/100 g注射STZ。术后自由进水进食。7 d后以微机血糖仪测定大鼠尾尖外周血血糖，非空腹血糖16.7～25.6 mmol/L为糖尿病造模成功。所有大鼠均造模成功。

1.2.2大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)大鼠模型制备：参照Zea-Longa法制作MCAO/R模型。以线体直径0.26 mm，线头直径0.36 mm的成品栓线栓塞大鼠右侧颈内动脉2 h，抽出栓线实现再灌注。假手术组按相同步骤切开及分离颈总动脉、颈外动脉后重新缝合皮肤，不插入栓线。尤瑞克林组大鼠于再灌后30 min给予舌下静脉注射尤瑞克林(8.75×10-3PNA单位/kg)，缺血组给予等量生理盐水，假手术组不进行注射。将大鼠放入鼠笼中饲养，自由饮食，室温保持在25℃。造模过程中缺血组1只大鼠因麻醉过量死亡，尤瑞克林组1只大鼠取脑时发现蛛网膜下腔出血给予排除。按随机原则补充2只。

1.2.3神经功能评分：分别于再灌注12、24和48 h各时间点处死大鼠前按照Bederson 6级5分制法进行神经功能评分。0分：无神经功能缺损；1分：对侧上肢不能完全伸展；2分：对侧肢体抵抗力下降；3分：提尾时向对侧转圈；4分：行走时自动转圈；5分：对刺激无反应，无自发性活动。评分≥2分表示MACO/R造模成功。

1.2.4脑标本制备：按脑缺血再灌注12、24和48 h处死大鼠，断头取脑，脑组织置4%(质量浓度)多聚甲醛液中固定24 h后，在视交叉后2～7 mm处垂直切取冠状切片，脑片厚度约5 mm，放入厚度与之相适应的石蜡包埋网盒备用。

1.2.5凋亡细胞数检测：采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡数目，严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。细胞核具有凋亡形态学特征且有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。随机选取脑缺血半暗带皮层组织内5个不相重复的视野，计算阳性凋亡细胞数目，取其平均值。

1.2.6caspase-12表达检测：采用免疫组化检测大鼠脑缺血半暗带皮层组织caspase-12表达。具体操作严格按照免疫组化检测试剂盒(S-P法)说明书进行。Ⅰ抗为caspase-12 Rabbit mAb。细胞胞质呈棕黄色者为阳性细胞。以MiVnT显微生物图像分析系统对图片进行分析，以平均灰度级表示阳性细胞率，平均灰度级值越低，表明染色越深，阳性细胞率越高。

1.3统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组均数间比较应用单因素方差分析，两两比较采用 SNK检验。取α=0.05。

2 结果

2.1大鼠外周血血糖测定MACO/R造模前假手术组、缺血组及尤瑞克林组平均血糖分别为(21.11±1.70)、(21.09±2.67)、(20.72±2.78)mmol/L，3组间比较无统计学差异(F=0.210，P=0.811)。

2.2神经功能评分假手术组大鼠神经功能评分均为0分，未见神经功能缺损，另2组大鼠出现不同程度的神经功能缺损表现。尤瑞克林组神经功能缺损评分低于缺血组(P<0.05)；缺血组及尤瑞克林组大鼠于再灌注24、48 h神经功能缺损评分均高于再灌注12 h时间点(P<0.05)。结果见表1。

2.3各组凋亡细胞数比较假手术组可见少量凋亡细胞，另2组大鼠缺血半暗带中均可见大量凋亡细胞。缺血组及尤瑞克林组大鼠于再灌注24、48 h凋亡细胞数均高于再灌注12 h时间点(P<0.05)；尤瑞克林组凋亡细胞数低于缺血组(均P<0.05)。结果见表2、图1。

2.4各组大鼠脑组织caspase-12表达假手术组脑组织caspase-12表达极低，另2组大鼠缺血半暗带中均可见caspase-12高表达。缺血组及尤瑞克林组大鼠于再灌注24、48 h的 caspase-12表达均高于再灌注12 h(P<0.05)。与假手术组比较，缺血组和尤瑞克林组大鼠脑组织caspase-12表达升高(均P<0.01)，且尤瑞克林组caspase-12表达水平均低于缺血组(P<0.05)。结果见表3、图2。

表1 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间神经功能评分比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与缺血组比较，bP<0.05；与同组12 h比较，cP<0.05；—：未进行统计学分析

表2 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间点脑组织凋亡细胞计数比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与缺血组比较，bP<0.05；与同组12 h比较，cP<0.05

注：细胞核内有棕黄色颗粒为TUNEL染色阳性细胞，细胞核呈蓝色为正常细胞 图1 各组大鼠脑缺血再灌注后不同时间脑缺血半暗带皮层组织凋亡细胞比较(TUNEL 染色，×400)

3 讨论

糖尿病是缺血性脑血管病的独立危险因素，高血糖状态可加重急性脑梗死发生后的脑损伤。国内外相关研究证实[1]，细胞凋亡在高血糖加重脑缺血再灌注损伤的众多机制中起着至关重要的作用，而内质网途径则是3条经典的细胞凋亡途径之一[3]。内质网是真核细胞中蛋白质翻译、合成和钙离子的存储场所，缺血、缺氧等各种外在条件刺激下，可引起其功能障碍，导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)发生。缺血缺氧的早期，ERS可纠正错误折叠蛋白或使未折叠蛋白重新恢复正常，但随应激时间逐渐延长及应激反应的逐渐增强，则引起细胞凋亡。caspase-12存在于内质网外膜，是caspase家族成员之一，caspase-12作为ERS介导的固有凋亡蛋白，与其他的caspase家族成员一样在生理条件下以无活性酶原形式存在，仅在ERS时才能被活化，非内质网介导的凋亡途径无caspase-12表达[4-5]。实验研究发现，caspase-12缺陷大鼠仅能抵抗ERS介导的细胞凋亡，而对其他死亡因子的刺激仍可引发细胞凋亡，充分证实caspase-12是ERS诱导凋亡机制的特异性因子[6]。本课题组前期有关糖尿病加重脑缺血再灌注损伤的细胞凋亡途径研究中，通过对比正常血糖组及高血糖组大鼠脑缺血再灌注后caspase-12表达的变化发现，与正常血糖组比较，高血糖组大鼠脑缺血半暗带中caspase-12表达显著增强，提示caspase-12介导的ERS可能是糖尿病加重脑缺血再灌注损伤的机制之一[7]。

表3 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间点脑组织caspase-12表达比较

注：表中数据为灰度级数值，其值越高表示caspase-12表达水平越低；与假手术组比较，aP<0.01；与缺血组比较，bP<0.05；与同组12 h比较，cP<0.05

注：细胞质呈棕黄色为阳性细胞，细胞结构较为完整且胞核呈蓝色者为正常细胞 图2 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间点脑组织缺血半暗带皮层caspase-12表达(免疫组化，×400)

尤瑞克林是从人类尿液中提取的一种由238个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶，能催化激肽原水解产生激肽，后者及其进一步降解产物能与缺血部位血管细胞产生的 B1 受体结合发挥扩张微动脉的作用。因 B1 受体仅在组织受缺血损伤后由损伤的组织血管内皮细胞诱导生成，故尤瑞克林可选择性扩张缺血区脑血管，提高缺血部位脑组织血流量，改善脑组织对氧的摄取[2，8]。近年来多项研究显示，尤瑞克林的脑保护作用与多个凋亡相关因子有密切关系，可通过上调Bcl-2表达，下调caspase-3、Fas-L蛋白、Bax蛋白表达，抑制p38MAPK活化等，从而抑制神经细胞凋亡，促进内源性神经再生[9-11]，改善神经功能缺损症状[12]，并被推荐用于缺血性脑血管病急性期治疗[13]。同时，在临床疗效观察中，对急性脑梗死合并2型糖尿病患者采用美国国立卫生研究院脑卒中量表(NIHSS评分)、改良Rankin scale(mRS评分)及日常生活能力量表(ADL评分)评定尤瑞克林治疗组和对照组患者疗效，表明尤瑞克林治疗2型糖尿病并发急性脑梗死疗效显著[14-15]，但其保护机制尚未明确。本研究结果显示，经尤瑞克林干预的大鼠于脑缺血再灌注后12、24和48 h其神经功能评分及脑缺血半暗带凋亡细胞数和caspase-12表达均低于缺血组，表明尤瑞克林对糖尿病大鼠脑缺血再灌注后的神经功能缺损具有保护作用，其保护机制可能是通过抑制缺血半暗带中的神经细胞凋亡实现，caspase-12可能参与了尤瑞克林对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制。

综上所述，本研究结果显示，尤瑞克林组大鼠脑缺血再灌注12、24、48 h神经功能评分、细胞凋亡数及caspase-12均低于缺血组，表明尤瑞克林对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经功能缺损具有保护作用，其作用机制可能是通过下调caspase-12表达从而抑制细胞凋亡有关。