急进高原轻-中度闭合性颅脑损伤后在不同海拔下伤情变化的观察

王昊 朱细燕 向洪义 廖志康 高谋 张溢华 张景宇 许明伟张楠 徐伦山 赵辉 许民辉

随着我国高原地区有轨高速列车及高速公路等交通运输条件的改善，进出高原地区的人群逐年增多，出现意外伤害的概率也同样呈增高趋势。据统计分析发现高原创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）呈现发生率高、增长率高、死亡率高、轻中型比例高等特点[1,2]。目前高原TBI已成为严重威胁常住及进驻高原地区人群生命健康的急性病之一[3]。文献报道，我国高原地区轻-中度TBI的发病率占高原TBI的80%以上[4]。但目前尚无高原地区发生的轻-中度闭合性颅脑损伤（mild-to-moderate closed head injury，mmCHI）后的救治指南，如果对损伤后伤情变化特点认识不足，不恰当地或盲目地转运到低海拔地区治疗，会使伤员深受其害，甚至付出生命的代价[5]。因此，本研究旨在探索急进高海拔地区mmCHI后的伤情变化以及在高海拔极限环境下TBI后快速转运是否会对TBI的救治带来积极的作用。本研究模拟快速进入高海拔地区后外力导致mmCHI，对 TBI在不同海拔高度（6.0、4.5、3.0 km）下动物的病理生理、神经功能如何变化进行初步观察，探索高海拔地区mmCHI后快速转运过程对TBI伤情的影响，并对其与海拔高度、救治时间窗的关系进行阐述。

材料与方法

一、实验材料

1.实验动物：雄性SD大鼠132只，体质量（200±20）g，购自陆军军医大学第三附属医院野战外科研究所[许可证号：SYXK（渝）20170002]，饲养标准为实验室饲养自由饮食和饮水，室内恒定温度18℃，光照周期为12 h。实验得到了中国人民解放军第三军医大学第三附属医院野战外科研究所伦理委员会的批准（注册号：ChiCTR-RPC-15006770）。

2.低压、缺氧处理：模拟急进高原不同海拔的低压、缺氧环境[6]。将实验动物置入低压舱（第三军医大学交通医学研究所重庆市车辆碰撞/生物碰撞与交通安全重点实验室，专利号：ZL201610421645.1），以400 m/min速度、15 min上升至模拟海拔6.0 km的高度，舱内气压-52～-57 kPa，氧含量 149 g/m3，海拔4.5 km条件下舱内气压-42～-47 kPa，氧含量176 g/m3，海拔3.0 km高度条件下舱内气压-30～-35 kPa，氧含量206 g/m3，低压舱湿度40%～50%，温度恒定于18℃，光照周期为12 h，自由饮食和饮水饲养。

3.造模与分组：模拟海拔6.0 km持续低压、缺氧条件下饲养24 h，大鼠用标准的小动物麻醉机喷流异氟醚麻醉（异氟烷1.5 L/min，浓度2%、机器：北京众实迪创科技发展有限公司，型号：zs-m），2 min左右可完成麻醉，后立即进行颅脑加速伤致伤造模，应用闭合性颅脑冲击伤模型为基础，将自由落体撞击改良为气动式撞击，条件 0.8 MPa（6.67 m/s，955.6 N±16.35 N）（第三军医大学交通医学研究所重庆市车辆碰撞/生物碰撞与交通安全重点实验室，专利号：ZL201610416956.9）[7]。排除颅骨骨折或因外伤后死亡的动物。将mmCHI大鼠按海拔高度分为3组：A组（伤后保持6.0 km，为阳性对照组）、B组（伤后下降至4.5 km）、C组（伤后下降至3.0 km），每组按时间点（6、12、24 h）分为 3 个亚组（n=12）共 108 只。另设空白对照组（海拔6.0 km留置24 h，n=6）与致伤组伤后24 h时体质量总体变化对比。

4.MRI检查：德国BRUKER7.0/20USR小动物磁共振，大鼠检查床及大鼠四通道表面线圈；VetEquip呼吸麻醉机（美国）；Thermo Scientific热水循环系统（美国）；心电、呼吸监控系统（Model 1025 System,SA Instruments,Inc,美国）。

二、实验方法

1.神经功能评分：实验前所有大鼠根据神经功能缺损评分（neurological severity score，NSS）标准，进行平原环境下为期3 d的适应性训练，进行横梁平衡、横梁行走训练[8]。致伤后30 min进行初始评分，观察并记录昏迷及呼吸暂停时间，随后将各组大鼠置入相应低压、低氧条件的低压舱内，分别在6、12、24 h时间点取出进行NSS评分，然后将大鼠麻醉称体质量，最后在相应时间点将大鼠处死检测脑含水量。

2.体质量测量：检测并记录所有待实验的平原环境（0.3 km）大鼠初始体质量（body weight，BW），大鼠模拟至海拔6.0 km后24 h时的体质量变化再次检测。致伤后在6、12、24 h对各组大鼠BW检测，记录各时间点体质量的变化情况。计算各组不同时间点的体质量与对应初始体质量的差值。

3.脑含水量检测：用戊巴比妥钠1%（v/v）麻醉大鼠，断头取出全脑组织。用精密电子天平（BSA124SCW，sartorius，德国）测定各脑湿质量。然后将这些组织放入恒温烘箱中，在80℃下加热48 h，直至获得恒定的质量。按照Elliot’s公式，脑含水量（brain water content，BWC）的百分比（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100%[9]。

4.头颅MRI检查：再次造模及分组（方法同前），随机抽取大鼠（每组 6 只，共 18 只），进行 6、12、24 h头部动态MRI检测。检查床温度为37℃±0.5℃，检查线圈为接收/发射四通道大鼠表面线圈，每组均进行冠状位T2磁共振加权成像，FOV均为35mm×35mm，层厚均为1mm，其中，T2RARE的参数为TR=3000ms，TE=45 ms，NEX 为 25，矩阵大小为 256×256。每组扫描参数均保持一致，采集相应图像。

三、统计学分析

运用SAS9.20进行统计分析，正态分布的计量资料（脑含水量）用均数±标准差（±s）描述，两因素设计的组间比较采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），进一步两两比较运用SNK法或简单主效应分析。非正态分布的计量资料（昏迷时间、NSS评分值、体质量值）用中位数和四分位间距描述[M(QR)]，两因素设计的组间比较采用Scheirer-Ray-Hare检验，进一步两两比较先对原始数据排序生成新变量后再采用SNK法。头部MRI检测通过使用Image J（NIH，版本1.47 V，美国）图像处理软件确定MRI中病灶的位置。通过手动选择检测区域，根据比例尺计算其面积（cm2）。检测区域测定值均采用均数±标准差（±s）表示。 采用 SPSS17.0（IBM）统计软件包进行双因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、致伤大鼠NSS评分比较

造模后致伤大鼠出现呼吸暂停及全身抽搐共有57只，分别占35.2%，死亡1只。剩余107只大鼠平均昏迷时间[M（QR）]：13.13 分±10.4 分，复苏后大鼠未出现肢体活动障碍，分别计算各个时间点每只大鼠的NSS分数与伤后初测NSS分数的差值。Scheirer-Ray-Hare检验结果显示，6 h NSS评分减少值[NSS（6 h）-NSS（30 min）]的中位数为 1（1～2），分别低于 12 h[NSS（12 h）-NSS（30 min）]的 2.5（1～5）和24 h[NSS（24 h）-NSS（30 min）]的 3（1～4），不同时间点的NSS评分减少值差异有统计学意义（H=10.29，P=0.001）；不同组别的NSS评分减少值的差异无统计学意义（H=0.81，P=0.858）；时间点和组别的交互效应无统计学意义（H=3.03，P=0.220）（图 1）。

图1 大鼠伤后神经功能随时间变化情况

二、大鼠体质量变化

平原环境的正常大鼠体质量中位数为215（205.3～221.2）g，低压舱（6.0 km）饲养 24 h 后体质量中位数为 190.0（182.8～200.6）g，体质量平均下降23.9（-26.4～-12.3）g，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2A）。致伤各组体质量组别效应结果示：C组体质量减少值中位数为8.6（6.8～12.8），分别低于A组的11.15（9.15～14.35）和 B 组的 10.3（8.4～13.8），差异有统计学意义（H=6.96，P=0.031）（图 2B）。 时间点效应显示：伤后0～12 h体质量减少值中位数10（8.7～10.4）高于 0～6 h 的 6.95（6.3～8.4），而低于 0～24 h的 14.4（12.8～16.5），差异有统计学意义（H=36.43，P＜0.05）。致伤组与对照组在24 h时体质量减少值差异有统计学意义（P＜0.05），时间点和组别的交互效应无统计学意义（H=6.58，P=0.721）（图 2C）。

三、大鼠脑含水量变化

大鼠急进高原mmCHI后6、12、24 h时BWC两因素方差分析结果显示，不同组别、不同时间点差异无统计学意义（P＞0.05）；时间点和组别的交互效应无统计学意义（F=1.758，P=0.148）。 BWC/BW（‰）结果显示，不同组别、不同时间点差异有统计学意义（P＜0.05）；时间点和组别的交互效应有统计学意义（F=10.280，P＜0.05）。 两两比较结果显示：在 6 h 中，C组比值低于A组和B组；在24 h中，B组比值低于C组和A组，且C组低于A组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。A组中，24 h比值高于6 h和12 h的比值；B组中，24 h的比值低于6 h和12 h比值；C组中，6 h比值分别低于12 h和24 h的比值，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。详细信息见表1。

四、脑核磁成像

急进高原mmCHI后下降不同海拔高度在6、12、24 h对大鼠脑组织行MRI检查表现为胼胝体体区（corpus callosum，CC）明显的高信号，侧脑室（lateral ventricles，LV）扩张明显（图 3）。

急进高原mmCHI大鼠CC肿胀的程度计算后数据使用两因素方差分析显示，不同组别、不同时间点的差异具有统计学意义（P＜0.05），时间点和组别的交互效应差异有统计学意义（F=69.561，P＜0.05）。mmCHI后6 h，A组与C组比较CC肿胀程度最严重（P＜0.05），而与B组比较差异无统计学意义。12 h，B组CC肿胀程度与A组和C组相比明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 24 h，C组 CC肿胀程度高于B组，但与A组比较CC肿胀程度却明显降低（P＜0.05）。A、B和C组时间点的单主效应差异具有统计学意义（P＜0.05）。A组伤后24 h时CC肿胀程度最低，明显低于12 h，但与伤后6 h比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与此相反，B组伤后6 h时CC肿胀程度明显高于12 h和24 h（P＜0.05）。C组伤后6 h CC的肿胀程度低于12 h，但高于24 h，各时间点差异有统计学意义（P＜0.05），详细信息见表2。

图2 不同海拔大鼠体质量变化及伤后不同组别、时间点效应

表1 3组大鼠脑含水量及其与体质量比值的比较

图3 急性低压、低氧轻-中度闭合性颅脑损伤大鼠在不同海拔的动态MRI影像表现

伤后大鼠脑室LV扩张程度使用两因素方差分析显示，不同组别、不同时间点差异具有统计学意义（P＜0.05），时间点和组别的交互效应差异有统计学意义（F=188.876，P＜0.05）。伤后 6 h，A 组 LV 扩张程度明显大于B组和C组；12 h，B组与A组和C组相比LV扩张程度最低；C组伤后24 h时LV扩张幅度明显大于B组，但低于A组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。各组在时间点的简单主效分析差异也具有统计学意义。A组LV扩张程度随时间延长呈现出持续扩大表现，伤后12、24 h时LV扩张明显大于在6 h时的脑室形态。B组伤后LV扩张水平随时间延长而下降，各时间点差异均具有统计学意义（P＜0.05）。不同的是，C组的LV扩张程度在伤后6 h也明显扩张，但在12 h时达到高峰后LV扩张程度开始下降，与12 h比较差异具有统计学意义（P＜0.05），详细信息见表 2。

讨 论

急进高海拔低氧状态将刺激呼吸中枢，导致肺通气量代偿性增加，即出现低氧式通气反应，以及急性高山病、高原脑水肿和高原肺水肿，加之机体在高原环境下的代谢产热减少，蒸发散热增加，丢失更多的水分，脱水表现明显，这些因素可都将增加TBI治疗中的困难[10-12]。本研究在以往研究的基础上进一步讨论急进高原mmCHI后的表现以及模拟快速转运至低海拔地区TBI伤情变化与这些因素的关系。

一、海拔高度与生命体征及神经功能的关系

实验发现急进高原mmCHI后发生呼吸抑制及肢体抽搐比例较高（35.2%），可能与伤后脑组织缺氧有关，伤后死亡率仅为0.9%，死亡原因可能为通气功能未恢复。NSS评分发现，随着时间的延长，不论海拔高度是否变化，各组致伤大鼠的NSS评分呈逐步改善的趋势，因损伤的程度较轻，各组别比较差异无统计学意义。但总体伤情变化趋势在各时间点表现不同，伤后6 h神经功能恢复低于12、24 h神经功能恢复的程度，说明急进高原mmCHI后早期神经功能恢复较慢，可能与急进高原mmCHI后出现意识障碍及呼吸抑制的比例较高有关。由于模型致伤程度较轻，对有呼吸抑制的大鼠进行快速的心肺复苏、保持呼吸道通畅可改善大鼠的通气及意识状态，神经功能也随之恢复较好。但高原mmCHI因伤情轻，容易被忽视，有一定死亡率。虽然各组在不同海拔高度下进行观察，但各组大鼠均在伤后24 h的NSS评分恢复至基本正常，NSS评分对判断高原mmCHI预后并不敏感。损伤后应重视改善伤后的通气功能，尽快实施心肺脑复苏，保证呼吸道通畅，改善供氧，同时采取早期救治可能会进一步改善伤情的进展。高原环境复杂，需要考虑在低压、缺氧状态下TBI后的继发性脑损害，因此，单纯依靠NSS评分不能准确评判mmCHI的伤情进展。

二、海拔高度与体质量变化的关系

有研究表明高原低氧暴露可明显改变机体的体液平衡，高山环境下通气的增加可导致不显汗（无知觉的水分丢失）增多，加上摄水减少，可引起水代谢的改变，急性低氧暴露可导致急性利尿，引起低氧环境下的脱水，导致在高原环境下的体质量减轻[13]。本实验也证实平原急进高原后动物体质量的变化，发现正常大鼠在急进高原后24 h体质量较在平原时明显减轻，随后进行mmCHI后6、12、24 h检测体质量，发现动物在伤后6 h体质量减轻的程度最小，低于伤后12 h和24 h时间点检测体质量，并且致伤后12 h体质量减轻的程度也低于伤后24 h，差异有显著统计学意义，表明急进高原mmCHI后，呼吸、意识状态、机体代谢受到影响，导致呼出过多的水分、进食、进水能力减退，造成大鼠更明显的体质量减轻。因此，体质量的改变与高原的海拔高度、低氧暴露的程度以及持续时间有关，高海拔极限环境下动物TBI后体质量随时间的延长而减轻，与伤情、伤后活动减少、摄食欲望降低、通气频率增快及脱水等密切相关[14]。所以，急进高原TBI后在积极救治的同时应改善机体体液流失的状况，补充足够的营养素和大量富含碳水化合物及电解质，有助于改善急进高原mmCHI后病理生理状态。

三、海拔高度与脑水肿的关系

多项研究已证实急进高原会导致血脑屏障开放发生高原脑水肿，并且随着低压、缺氧程度加重高原脑水肿的程度也会加重，在高原环境下发生的TBI后脑水肿可能会更加严重[15,16]。实验发现动物伤后滞留于高海拔6.0 km，脑含水量会随时间延长呈逐渐升高趋势，而下降至中高海拔4.5 km及低海拔3.0 km地区的脑含水量则呈现出下降趋势，但组间比较差异没有统计学意义，因此需要考虑机体在高海拔地区损伤后体液的丧失程度，计算不同海拔高度下各时间点脑水含量占总体质量百分比值。既往研究表明，在平原地区闭合性TBI后脑水肿首次出现在损伤后24 h，并且在5～8 d达到高峰[17]。但在高海拔地区TBI后脑水肿的变化有明显不同，实验数据表明，急进高原mmCHI后0～24 h的时间内A组比值仍然呈持续上升趋势，0～6 h C组动物BWC/BW比值最低，这是因为高原暴露的大鼠在致伤后快速下降至3 km后体质量下降最少，因此BWC/BW比值最小，也说明高海拔地区脑含水量与体质量变化是具有相关性的。由6.0 km下降至海拔4.5 km和3.0 km的2组动物在致伤后的比值在12 h时达到高峰后比值开始下降，在24 h时B组BWC/BW比值下降程度明显大于C组。说明高海拔环境暴露后的mmCHI后BWC/BW的变化与时间、海拔高度存在相关性，急进高原mmCHI后脑水肿程度较平原发生时间更早、更严重，而由此引起的早期颅高压增高会加重脑组织缺血缺氧，造成恶性循环，伤后不应继续原地救治，应在早期进行改善通气后快速阶梯下降到较低海拔地区进一步治疗，而不应直接下降至低海拔地区，这对缓解脑水肿有利。

四、海拔高度与头部MRI的动态变化

脑核磁共振检查目前已被用于许多高海拔地区脑损伤的研究，本实验首次对急进高原地区24 h后mmCHI的伤情变化进行了连续3个时间点的MRI动态观察，结果发现被撞击区域脑皮层无挫裂伤、水肿及血肿，这符合mmCHI的表现。以往研究发现在中重度TBI的患者中多有轴索损伤及蛛网膜下腔出血表现，轴索损伤病理表现在脑中线白质与灰质交界处、胼胝体、脑干区[18]。脑室扩张也是TBI患者常见表现，并且是伤后出现脑积水的主要原因，最新研究表明，TBI后蛛网膜下腔出血及脑室出血可能导致TBI后24 h内发生急性脑室扩张，然而具体机制仍不清楚[19]。在本实验中，大鼠急性低压、低氧状态下mmCHI后6 h的MRI扫描可见明显的胼胝体高信号和双侧脑室扩张，提示高原mmCHI后会出现轴索损伤，同时脑室扩张也较平原出现的更早，但并没有发现蛛网膜下腔和脑室出血，这表明伤后胼胝体肿胀、急性脑室扩张与低压、低氧有密切关系，这种情况将导致严重的颅内高压及继发性脑损伤，如果忽视将会出现严重的后果。在随后的12、24 h的MRI观察发现，下降海拔高度的2组（B组和C组）大鼠头部MRI异常区域均出现逐渐改善，且明显好于伤后继续滞留在6 km海拔的大鼠。并且，阶梯下降海拔高度（缓慢复氧）的B组大鼠损伤区域的改善程度好于快速下降海拔高度（快速复氧）的C组大鼠。说明持续低压、低氧及快速升压、复氧均对损伤后脑组织伤情改善不利。

综上所述，处于高海拔极限环境下所受的mmCHI应提高重视，在伤后应早期改善通气，分阶段下降海拔高度治疗，避免继续滞留在低压、低氧环境以及快速、大跨度送至低海拔地区后造成更严重的继发性神经功能损害。在治疗上应关注高海拔地区TBI后出现的严重脱水、继发性脑肿胀对机体带来的损害。